猪精液冷冻技术研究

      1956 年英国人Polge 开始研究猪精液的冷冻保存。后来的研究中，利用牛精液冷冻方法冷冻猪精液，解冻后的精子具有活力，但没有受精能力，虽然在1970 年之前有几例猪冻精成功受胎的报道，但其结果不能被重复。1970 年，Polge 利用外科腹腔授精法将解冻后的精子直接注入输卵管，并获得83%的受精卵。随后Crabo 和 Einarsson（1971）、 Graham 等（1971）、 Pursel 和Johnson（1975 ）相继报道了以常规的子宫颈输精并成功分娩的冻精技术试验结果，证明超低温冷冻保存后猪精子仍具有受精能力。此后各国研究者为了把猪的精液冷冻技术应用到养猪生产实践中作了大量的工作，并对操作程序进行不断优化。但冻精的使用仍没有得到大范围推广，主要原因是繁殖成绩不理想。

1  猪精液冷冻原理
        猪精液冷冻技术是指利用干冰(-79 ℃)、液氮(-196 ℃)、液氦(-269 ℃)等作冷却源，将精液经特殊处理后，保存在超低温状态下，使精子细胞的代谢完全停止，达到长期保存精液的目的。需要使用时经解冻便可用于输精。
        在冷冻过程中，细胞会受到2方面的损害：冷冻时细胞外溶液首先形成部分冰晶，从而使未结冰的部分溶液浓度增高，形成高渗溶液，这时精子内水分向外渗透，导致精子过度脱水、淹渍而死，这就是冰晶化导致的化学性损伤(也称为溶液效应)；同时细胞内外形成的冰晶对细胞膜及细胞的内部结构产生机械性损害，导致细胞死亡，这是冷冻的物理损伤。损伤的程度一般由冷冻——解冻速率和冷冻——解冻温度所决定。
        冷冻过程中，细胞内形成冰晶是不可避免的。控制所形成的冰晶的大小和数量，减少或不形成能够对精子造成物理性损伤的大冰晶，而仅维持在微晶状态，就会减少对精子的损伤。为了减少冷冻——解冻过程中冰晶对精子的损伤，在冷冻液中添加冷冻保护剂，如卵黄、DMSO、丙二醇、乙二醇、甘油、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮等，同时控制冷冻——解冻时的冷冻——解冻速率以减少冰晶的形成，避免冰晶对膜的损伤，使精子安全通过0～-60 ℃低温区域(冰晶化危险温度区)，从而保证精子存活。

2  冷冻保存承载工具　
        早期研究中，猪的精液采用玻璃瓶或玻璃试管和较高浓度的甘油溶液进行冷冻保存。后来，牛的粒状干冰方法被应用到猪上，把甘油溶液浓度降到1%～3%的范围，可以实行快速冷冻降温操作。随后猪精液冷冻又采用5 mL 大型细管、5 mL不同类型的塑料袋、4～5 mL 铝袋、1.7～2.0 mL扁平细管、0.5 mL 中型细管和0.25 mL 微型细管保存。
保存承载工具的优缺点：
        第一，5 mL 的大型细管具有1 头份的输精剂量，方便输精，但其表面积/容量比较小，内外温差较大，细管中的精子受冷不均匀，达不到理想的冷冻和解冻速率，冷冻——解冻后精子活率较低，限制了理想的冷冻和解冻过程。Weitze 等（1987）报道，大型细管冷冻猪精液，管周的冷冻速率是中央的3.75 倍，冻后精子活率显著低于小直径细管。
        第二，5 mL塑料袋也含有1 头份的输精剂量，表面积/容积的比例较大，在冷冻和解冻过程中能够均匀的进行热传递，减少了冷冻及解冻的时间，从而减少了冰晶形成对精子的损伤。所以冷冻——解冻后精子活率高。但其体积太大，不适合放置在液氮罐中保存。目前改进后的塑料袋，在不改变冷冻效果的前提下，减少其体积以适应在液氮罐中保存。如：FP（Flat-Pack，300 mm×22 mm×0.2 mm）和MFP（a multiple Flat-Pack）等。这种改进的保存承载工具目前仍处于验证阶段，尚未完全应用于商业生产。
        第三，颗粒、0.25 mL、0.5 mL小型细管和扁平细管，有较大的表面积/容量比，其形状适合低温冷冻保存。但颗粒的冷冻精液较难进行不同头份及来源的标记与区分，容易造成交叉污染，且颗粒和小型细管冻存的精液量太少，1头份的输精剂量一般需要解冻50颗颗粒、10～20根小型细管或2～3根扁平细管，因此不利于输精和生产上普遍推广。
        总之，用表面积/容积较大的承载工具冷冻精液，可以达到较好的冷冻和解冻速率，提高冷冻效果。而从生产应用的方面考虑，5 mL 细管、平管和塑料袋是比较好的猪冷冻精液承载工具，更值得深入的研究。目前生产实践中，仍以传统的颗粒冷冻和大的细管冷冻为主。

3  冷冻稀释液及解冻液
3.1  冷冻稀释液
        稀释液是精子的保护剂，对精液的冷冻效果起决定性作用。目前在大量科研工作者的努力下，已经研制了多种稀释液。在猪精液上因存在多种冷冻方法，所以其冷冻稀释液的组成成份也因冷冻方法的不同而不同。
        猪精液冷冻稀释液主要分为2类：
3.1.1  不含缓冲盐的冷冻稀释液
1）egg yolk glucose （Baier, 962; Polge et al.， 1970 ）
2）egg yolk lactose,（Richter， et al.， 1975; Westendorf， et al., 1975）
3）egg yolk saccharose EDTA, Mg and Ca salts（Milovanov ，et al., 1974）
3.1.2  含缓冲盐的冷冻稀释液
1）glycine phosphate and glucose phosphate（Iida and Adachi, 1966）
2）egg yolk glucose citrate（Serdiuk, 1970）
3）egg yolk glucose citrate EDTA potassium unitol–urea（Shapiev et al., 1976）
4）Beltsville F3（BF3; Pursel and Johnson, 1971）
5）Beltsville F5（BF5; Pursel and Johnson, 1975）
6）Tes-tris-fructose–citrate–egg yolk（TEST; Graham et al., 1971）
7）Tes-NaK glucose egg yolk（Crabo and Einarsson, 1971; Larsson et al., 1977）
8）Tris-fructose EDTA egg yolk（Salamon and Visser, 1973）
9）Tris-glucose EDTA egg yolk（Park et al., 1977）
        目前国外冷冻猪精液多使用细管法冷冻，先用贝兹维尔解冻液(beltsville thawing solution，BTS)稀释，再离心，离心后将精清去除，然后加入冷冻液(11%的乳糖、20%的卵黄及一定含量的甘油)进行稀释并冷冻。而国内冷冻多使用颗粒法冷冻，一般的稀释液都由糖类、蛋白质、脂类、缓冲液、冷冻保护剂和其他的添加物质所组成，加入稀释液前可以离心除去精清，也可以直接加入稀释液，然后经一段时间的平衡，再加入含保护剂的冷冻液进行冷冻。
3.2  解冻液
        目前已经提出了若干种解冻液中，大致可分为含蛋白质解冻液和含盐类解冻液2大类。
3.2.1  含蛋白质解冻液
        精清被认为是一种基本的解冻液。已经证明，在精清中解冻既能提高精子存活率，又能改善精子在母畜生殖道内的运动，并能提高受精率。事实上，无蛋白质的精清或OLEP合成的公猪精清在精子存活率及谷-草转氨酶活性和受精率反应方面都和精清一样有效。精清对于冻融影响公猪精子受精率的作用目前仍然不清楚。脱脂奶用作解冻液时，培养后的精子存活率很低。
3.2.2  含盐类的解冻液
        目前，最常用的解冻液都以含盐溶液为主。这类解冻液包括：BTS、Hwlsemberg 解冻液、OLEP解冻液以及INRA ITP解冻液。猪目前主要应用的是BTS。
3.3  冷冻保护剂及添加剂
        冷冻保护剂能够增强精子抗冻能力，维持精子活力和保护精子膜，提高精子的活率和正常顶体的完整率，并对防止冰晶的发生起重要作用，从而能够提高精液的冷冻效果。
在冷冻液中添加的冷冻保护剂主要有：卵黄、奶类、蔗糖、葡萄糖、果糖、乳糖、聚乙烯吡咯烷酮、DMSO、丙二醇、乙二醇、甘油、柠檬酸钠、乙二胺四乙酸二钠、氯化钾、磷酸二氢钾、Tris、OEP及其类似物、HBCD、HA、N-乙酰基-D-葡糖胺、α-维生素E、GSH等。

4  稀释方法
        精液的稀释程度关系到冷冻的成败。精液稀释的重要目的是保护精子在降温、冷冻和解冻过程中免受低温损伤。随着试验及生产的需要，例如增加所采精液的输精次数或调整输精剂量中的精子数，稀释的比例常有变化。
        目前猪精液稀释方法主要分为3种：
4.1  一次稀释法
        将采出的精液用含有甘油的等温稀释液按比例要求一次加入。常用于颗粒精液，近年也应用于细管型、安瓿型或袋装精液。这种方法使得甘油对精子的化学损伤作用较大。
4.2  二次稀释法
        此法可尽可能减少甘油对精子的有害作用。具体方法是将采得的精液在常温的等温条件下，立即用不含甘油的第Ⅰ液，根据精液品质按比例稀释。稀释后的精液先缓慢降温至15 ℃维持4 h，再从15 ℃经1h降至5 ℃，然后用等温的含甘油的第Ⅱ液进行稀释。
        猪还有一种独特的二次精液稀释法：将采集的浓份精液，直接放到保温瓶中在室温环境下静置2 h，再进行离心（800 g，10 min），除去精清，并作第1次稀释；然后2 h降温至5 ℃，再作第2次稀释。
4.3  三次稀释法
        精液采集后，首先用Beltsville thawing solution (BTS，Pursel and Johnson, 1975)进行第一1次等温稀释(1:3, v/v)，稀释后移入15 ℃条件下降温平衡3 h，冷却降温后进行离心（800 g，10 min），离心后弃除上清。然后在15 ℃条件下，用乳糖-卵黄稀释剂(LEY) 进行第2次等温稀释（1/2:1, v/v），稀释后缓慢降到5 ℃，平衡2 h。然后在5 ℃条件下，用含甘油的乳糖-卵黄稀释剂(LEY) 进行第3次等温稀释，稀释后的精液取样镜检活率应不低于原精液，方可分装并用于制作冻精。3次稀释法是目前比较流行的方法，适用于各种细管及扁平袋等的冷冻。
5  冷冻方法流程
5.1  冷冻原则
        冷冻过程中的精子细胞不但要对保存温度 (-196 ℃)有耐受能力，而且要能经受从射精时机体温度到保存时超低温度的变化，且活率不能过度降低。因此，后者比前者显得更重要。每种细胞都有它理想的冷冻与解冻速率，Mazur等(1972)给出2条理论原则：
        第一，冷冻速率太慢时，与冷冻保护剂接触时间过长，精子容易受冷冻保护剂的化学损伤作用而死亡或遭受破坏。
        第二，冷冻速率过快时，细胞内液体易导致结冰现象，对细胞造成物理或化学损伤。解冻时的原理恰好相反。
5.2  冷冻程序
5.2.1  颗粒法冻精的冷冻程序
        将采集的精液在常温的等温条件下，立即用不含甘油的第Ⅰ液，根据精液品质按比例稀释。稀释后的精液先缓慢降温（用纱布包裹）至15 ℃维持4 h，再从15 ℃经1 h降至5 ℃，然后用等温的含甘油的第Ⅱ液进行稀释。稀释后用液氮熏蒸法制作冻精颗粒。利用广口液氮罐，以聚四氟乙烯板作为冷冻面，冷冻面与液氮面距离为1～2 cm，待冷冻面充分预冷后，用预冷的滴冻管在氟板上连续等量滴冻。其始冻温度为-110～-125 ℃，滴冻时间控制在60 s 内完成，加盖熏蒸平衡3～4 min后，浸入液氮中保存。
5.2.2  细管法冻精的冷冻程序
        目前细管法和塑料袋法的冷冻主要采用Westendorf等（1975）设计，经Bwanga等（1990）改进的冷冻及解冻方法，现已基本成为常规标准：
1）将采集精液在室温下，用BTS稀释液将精液按比例等温稀释，稀释后的精液继续在室温下平衡。
2）室温平衡后，将精液移入15 ℃条件下降温平衡3 h。
3）平衡后，在15 ℃条件下离心（800 g，10 min）。
4）离心后，弃掉上部4 /5 的精清，然后加入无甘油的冷冻稀释液，使其温度缓慢降到5 ℃，平衡2 h。再于5 ℃条件下，加入含甘油的冷冻稀释液后分装。
5）分装后的精液，置于冷冻支架上并移入程序冷冻仪内，初始温度为5 ℃，以3 ℃/min从5 ℃降到-5 ℃，再于-5 ℃条件下保持1 min结晶，然后以50 ℃/min从-5℃降到-140 ℃，最后投入液氮保存。
为了避免冰晶对膜的损伤，使细胞安全通过0～-60 ℃低温区域(冰晶化危险温度区)，冷冻时冷冻速率在不同的研究中不尽相同，不同的包装剂型需要的最佳冷冻速率也不相同，目前还有待进一步研究。当使用冷冻精液时，将保存的精液从液氮中取出，先放入水浴中解冻，解冻后在37 ℃下检查精液品质，品质合格的精液才可以用来输精。
5.3  冻精的解冻方法
        冻精的解冻过程同冷冻过程一样，必须通过精子冰晶化的危险温度区，才不致于对精子细胞造成损伤。试验证明，解冻速率比冷冻速率对精子质量的影响更大（Eriksson等，2000）。因此，解冻速率是影响精子质量及存活的一个重要因素。
5.3.1  细管（塑料袋）冻精的解冻
        从液氮中取出冷冻精液，迅速在循环水浴锅中解冻。不同的细管（塑料袋）冻精，由于其包装剂量等参数不同，所需要的解冻条件不同。Eriksson等（2000）认为50 ℃条件更适合5 mL扁平袋（Flat-Pack）和5 mL细管，其解冻时间分别为：13 s，40 s。 对于0.5 mL细管，采用50 ℃，12 s或37 ℃, 20 s解冻，效果都比较好。解冻后的精液在室温（20 ℃～25 ℃）下，用预热的BTS根据检测所需比例重新进行稀释。
5.3.2  颗粒冻精的解冻
        颗粒冻精可以在解冻液中（湿解冻）或试管中（干解冻）解冻。
1）干解法
        将灭菌的玻璃试管置于35 ℃～45 ℃的水浴中，恒温后，投入精液颗粒，并迅速摇动试管至溶化，然后加入20 ℃～30 ℃的解冻液。
2）湿解法
        解冻前先将解冻液装入灭菌试管中，置于35 ℃～45 ℃的水浴中预热， 恒温后，投入精液颗粒，并迅速摇动试管至溶化。
        解冻后的稀释精液为25 ℃～26 ℃，应在15 min内输精。对于猪冷冻精液颗粒的解冻，干解冻法操作简单，适于大批量颗粒冻精的解冻。

6  冷冻效果
        生产上，猪精液冷冻主要是颗粒法、5 mL细管法及5 mL扁平袋（Flat-Pack）法，其中5 mL细管法及5 mL扁平袋（Flat-Pack）法保存效果要优于颗粒法。采用常规人工输精方法——子宫颈输精法（intra-cervical insemination，intra-CAI），对自然发情母猪进行2次人工授精（50亿～60亿/次）后的结果显示：5 mL扁平袋（Flat-Pack）法的效果最好，产仔率与平均窝产仔数分别达到72.2%，10.7头（Eriksson et al，2002）； 5 mL细管法的产仔率与平均窝产仔数分别为62.6%，9头（Hofmo and Grevle，2000）；颗粒法最差，产仔率与平均窝产仔数仅为40%，6.4头（Didion and Schoenbeck,1996）。
        随着输精技术的改进——新的子宫角输精法（deep uterine insemination，DUI）的采用，最大限度地降低了猪精液的输精量。这种非手术的子宫角输精法是由Martinez等（2001）采用一种柔性光纤内窥镜（长度：1.35 m；外直径：3.3 mm；内直径：1.2 mm）实现的。这种输精装置插入到子宫角的时间为4.1±0.26 min。应用新的子宫角输精方法的鲜精（每次10亿，2亿，0.5 亿）输精效果与常规输精法（30亿/次）在产仔率与平均窝产仔数上差异不显著（Martinez，2001）。
在猪的冷冻精液方面，新的子宫角输精方法使冷冻精液的输精量降为10亿/次，而不影响输精效果，这使得0.5 mL细管冷冻法应用到生产上成为可能。其中，采用激素诱导，一次人工授精，产仔率与平均窝产仔数分别达到77.55%，9.31头（Roca et al， 2003）；而对自然发情母猪，进行2次人工授精，产仔率与平均窝产仔数也分别达到70.1%，9.18头（Bolar′n et al，2006）。

7  存在问题和应用前景
        猪精液冷冻技术的研究目前还处于试验阶段，主要原因是理论上对猪精液冷冻过程中的冷冻—解冻机理、精子损伤机理、在冷冻—解冻过程中外部环境变化对精子的影响、精子内部组成物质的变化规律及分子机制等诸多方面尚不完全清楚；在实际操作中冷冻——解冻程序和稀释液、解冻液的组成不一致，甚至差别较大；在生产上存在着输精剂量和方法不同，冻精受胎率和产仔数比鲜精低，操作程序复杂等因素而难以推广应用。对于猪精液冷冻技术目前存在的问题，还需从以下几方面着手解决：第一，从理论上研究冷冻和解冻过程中精子内部结构发生的变化；第二，探讨影响猪精子冻后存活的内外因素；第三，筛选简易高效的稀释液和解冻液配方；第四，研究并确定简单而高效的冷冻和解冻方法。
        虽然猪精液冷冻的研究目前存在诸多困难，但对其研究具有非常重要的意义。从理论上来说，猪精液的冷冻保存、猪卵母细胞冷冻保存、猪胚胎冷冻保存联合应用，对建立优良品种猪的种质资源库，保存优良品种资源具有不可替代的作用；探讨猪冷冻精液的影响因素和冷冻机理，对其他家畜精液冷冻研究也具有重要参考价值。在生产实践中，精液冷冻保存可以使精液得到长期保存，使精液的使用不受时间和地域的限制，有效提高公猪的利用率，充分发挥优良公猪的作用，降低活体保种的成本，防止优良基因的漂变和传染病的发生，利于深入开展猪的联合育种工作，在保护地方优良品种与加快品种改良等方面具有重要的研究价值和广泛的应用前景。

来源：猪业科学