正确制作、谨慎使用自家苗

　　养猪信息网综合整理 近年来随着我国生猪养殖规模和养殖数量的增加，引进的外来品种越来越多，市场的流动性增大，各养殖猪场在消毒、防疫、治疗措施等方面也存在很多空白的地方，造成现在各种猪病的广泛发生和传播，也使得当前猪病的特点呈现多样化和复杂化。当前某些疾病的暴发使得国内市场上还没有针对该疾病的确切免疫保护效果的商品疫苗供应，因此为了挽救不可估量的经济损失，有的猪场使用自制自家疫苗免疫。尽管有关专家呼吁不能长期或随意使用自家疫苗，但自制自家疫苗还是经常被用来在特定时期救急，提醒广大养殖朋友对于自家苗一定要正确制作、谨慎使用。

　　1材料与方法

　　1.1.仪器设备 37℃恒温培养箱、洁净组织搅碎机、解剖刀、电子天平、烧杯、绞肉机、不锈钢圆盘、量筒、玻璃棒、漏斗、灭菌纱布、100毫升灭菌疫苗瓶、干热高温灭菌箱、无菌操作台、酒精灯、灭菌平皿、EP管架、移液器及其灭菌枪头、镊子、接种环、摇菌床、瓶盖封口机、灭菌移液管(10毫升)、250毫升细胞瓶、酸缸、吸耳球、C02培养箱、倒置显微镜、4℃冰箱、-20℃冰箱、-80℃冰箱、匀浆机等。

　　1.2材料试剂 生理盐水、蒸馏水、甲醛溶液、症状典型的病料、TSA、TSB、DMEM(营养液含10%小牛血清和氨基葡萄糖、维持液含2%小牛血清)、PK-1.5细胞、双抗(青、链霉素)、胰蛋白酶等。

　　1.3自家苗制作

　　1.3.1自家组织苗制作 选取患有典型症状且没有用抗生素治疗的病猪，用解剖刀宰杀放血，剖开胸腹部，选取肺脏、脾脏、淋巴结(主要是腹股沟淋巴结和肠系膜淋巴结)等器官作为主要病料，如果肝脏和肾脏病变较明显，也可选取病变明显部位作为辅助材料，但要尽量保证病料的新鲜，防止其他杂菌污染，以确保组织苗的效果。如果不能及时处理病料，则需要把病料密封好放在-80℃低温处保存。将选取的病料放在已灭菌的绞肉机中绞2～3次，试估计其重量。取相当于病料重量25%～35%的生理盐水加入病料中混匀，放人组织捣碎机中捣碎.12000转/分钟捣碎约2—3分钟，将捣碎的病料放入不锈钢圆盘中密封，最后放人冰箱中冷冻，完全冻结的病料取出后溶解，如此反复冻融三遍，再将解冻的病料与生理盐水按1千克：3500—4000毫升的比例进行稀释调兑，之后用双层无菌医用纱布过滤，然后将过了两层纱布的滤液再过两次四层纱布，最后所得滤液中加入0.8%的甲醛，一小时摇匀后，置37℃恒温箱中灭活，灭活时间不能太短。灭活期间，每4～6小时摇动一次约半小时，48小时后灭活完毕，分装前按1500国际单位/毫升比例加入双抗(青霉素和链霉素)，另外还可加入一定量的黄芪多糖并摇匀，以增加猪只抗体的生成，再移至无菌操作台中无菌分装于100毫升疫苗瓶中，封口后置于40℃ ~8℃下保存待用。

　　1.3.2自家细菌苗制作

　　取本场患有典型症状且未用抗生素治疗过的病猪，放血解剖，取猪体肺脏、脾脏、猪脑积液或患有关节炎的猪腿关节液于无菌操作台上接TSA平板。若无备用TSA固体平板，先密封病料于-20℃低温保存，并立即以蒸馏水和TSA粉末按24：1的比例调配TSA溶液并于114℃下灭菌16分钟，之后在水浴锅内冷却至45℃左右时于无菌操作台上加入5 %的无支原体小牛血清和0.15%的NAD并摇匀，同时倒制无菌TSA平板冷凝待用。接菌的平板于37℃恒温培养箱下保持生长约18小时左右直至菌落形成，观察菌落形态并进行细菌纯化、生化鉴定和革兰氏染色。据统计，当前临床猪细菌病当中主要以副猪嗜血杆菌、链球菌、巴氏杆菌、波氏杆菌、胸膜肺炎放线杆菌、大肠杆菌等的原发或继发感染为主。TSA固体平板上鉴定纯化的细菌用TSB液体培养基洗下作菌液并转于500毫升葡萄糖瓶内的300毫升TSA液体培养基内37℃摇菌扩大培养约18小时，其中TSB液体培养基以蒸馏水和TSB粉末按33：.1的比例调配并于114℃灭菌16分钟，冷却后再加入1.2‰的NAD。扩大培养的细菌再以0.8%甲醛于37℃下摇床摇菌灭活20小时左右，灭活的细菌再接TSA平板37℃恒温培养18小时左右，根据平板上的细菌生长情况判断细菌甲醛灭活是否彻底。同时进行细菌计数和细菌浓缩，以判断抗原量和提高抗原量，若抗原量过大，可用灭菌生理盐水稀释。当验证已灭活彻底且抗原量达标的细菌方可于无菌操作台内无菌分装于100毫升疫苗瓶中，封口后置于4℃~8℃下保存待用。

　　1.3.3自家病毒苗制作

　　用于病毒分离的细胞主要是猪源猪肾细胞系，如PK-15细胞，它可用于分离猪瘟病毒、猪蓝耳病毒、猪圆环病毒、猪细小病毒、猪轮状病毒和猪冠状病毒等等。经酸缸处理并用清水洗净的细胞瓶干热高温灭菌后置于紫外灭菌的超净操作台内，用无菌洁净移液管往细胞瓶内加入30毫升DMEM营养液。同时用移液管加入5毫升左右的PK-15原代细胞并吹散混匀，置于37℃恒温C02培养箱内48小时，其间于倒置显微镜下观察细胞的生长情况，当细胞贴壁生长规律且无其他杂菌污染时便可进行下一步的细胞传代和放大培养。经48小时后的PK-15细胞瓶内残液于超净台内倒掉，同时无菌条件下往瓶内加入4毫升左右的胰蛋白酶溶液，使酶溶液浸没贴壁生长的细胞后立即倒掉，然后再无菌加入4毫升左右的胰蛋白酶溶液，置于37qC恒温培养箱保持3分钟左右，取出于倒置显微镜下观察细胞是否脱落分散，之后于超净台内再倒掉残液，再加入10毫升左右DMEM营养液并用移液管反复吹打，使得贴壁细胞充分吹散，然后吸5毫升左右细胞液转移至新的细胞瓶传代和放大培养。

　　取经PCR或RT-PCR检测为病毒感染阳性的病料约200毫克置于冷冻管内，加入0.1M(摩尔浓度)浓度的PBS缓冲液600微升，匀浆机以5米/秒匀浆30秒破碎组织病料，然后反复冻融已破碎的组织病料三遍使得组织内感染的病毒释放，12000rpm(每分钟转数)冷冻离心7分钟并取上清，上清液用灭菌注射器吸人并注入0.22微米孔径滤器过滤，滤液中加入双抗，并再次以相同孔径的无菌滤器过滤，所得滤液即为本场病料组织中所分得的含有双抗的病毒液，此病毒液可直接接上细胞使得病毒生长繁殖。待接毒的生长细胞以正好生长了36小时左右的细胞为宜，接毒之前应于超净台内倒掉细胞瓶中的营养液，然后无菌注入含有双抗的病毒液并在37℃下让病毒吸附细胞瓶中的细胞1小时，之后再往已接毒的细胞瓶内无菌加入DMEM营养液约35毫升并于37℃ C02培养箱内保持约的病毒液方可于无菌操作台内无菌分装于100毫升疫苗瓶中，封口后置于40℃—8℃下保存待用。

　　1.4安全性和有效性的检查 在投入使用之前，必须对生产出来的自家苗进行安全性和免疫性效果的检查。主要是检测疫苗是否灭活彻底，是否确实有效。由于病料中含有的抗原种类很多，临床上只做一些简单的动物试验。检测试验主要包括：①甲醛灭活后的自家苗进行小白鼠腹部注射2毫升，观察24小时;②镜检细菌数量，并做好记录。在全场注射之前先用一两窝猪仔作一下试验，观察两天，看有没发生过敏、或注部位发生炎。如果没有不良反应，方可全场铺开注射免疫。

　　2自家苗的优缺点

　　2.1自家苗的优点

　　2 .1.1抗原成分多 组织苗制备时的病料来源于发病动物，特别是具有典型症状的病料，经粉碎灭活后大量制备的自家疫苗，其抗原成分基本包括了本场引起疾病的病原，比较全面的抗原有可能在一定程度上对接种的动物群体进行全面的、多方面的诱导，如果灭活到位，有效抗原和位点保留恰当，那么在接种后就会在不同个体间产生不同程度的免疫反应，以达到预防和抵抗疾病的目的。吴礼洁等分离猪链球菌制备蜂胶佐剂自家灭活苗配合使用敏感药物，受到了良好的效果。杨彦伟等(2004)将基因工程疫苗与自家苗同时用于仔猪黄白痢的预防，结果表明，自家灭活苗对仔猪黄白痢的防治效果K88-K99-987P-F41四价灭活苗效果明显;吕才火等(2004)制备自家组织灭活苗应用于猪蓝耳病和传染性胸膜肺炎的混合感染：王自振等(2003)制备自家苗对传染性胸膜肺炎的防治，效果都很好。

　　2.1.2具有一定的针对性 对于某些病原体，存在很多不同的血清型。国内不同地区都有其独立的血清群，有时即使是在同一地区不同猪场血清型之间的差异也会很大，甚至在同猪场的同一批猪中也会存在不同的血清型。不同的血清型之间的抗原交叉保护力较弱，不可能制备一种覆盖所有的血清型的超广谱疫苗。这样就会使得某些单一商品疫苗在一定程度上失去了它的免疫保护效应。这在一定程度上使用自家苗也可以说是一项救急措施。

　　12.2自家苗的缺点 专家和政府呼吁绝不可以滥用自家疫苗!从长远来看，滥用自家苗将会造成某些后患，养猪场的疾病会越来越难控制。因此，在使用自家苗之前一定要考虑周全，在考虑到其优点的同时也一定要考虑到使用自家苗的缺点。

　　2.2.1灭活问题和散毒的可能 对于自家苗灭活的问题上存在着很大的风险性，细菌和病毒的甲醛灭活浓度就不尽相同，需氧菌灭活时需要的甲醛浓度为0.1%~0.2%，厌氧菌灭活时需要的甲醛浓度为0.4%—0.5%，而病毒灭活时需要的甲醛浓度0.05%—0.4%，并且，有些病毒如猪瘟病毒用甲醛灭活的效果不理想，所以在制作不同疫苗的时候，对灭活剂的浓度和灭活剂的种类要求是不一样的，灭活剂的种类和灭菌浓度选择的不合理，就无法达到灭活的效果。甲醛浓度太低造成自家苗灭活不彻底，浓度过高，破坏抗原的免疫原性，使得免疫效果变差，同时会产生刺激或发生损害作用，无论是过高还是过低，同样都会造成巨大的经济损失。制作自家苗是采用具有典型病变的组织为原料，而动物死亡之前可能会继发或者混合感染其他的病原体，而这些病原体灭活时对甲醛浓度的要求各不相同，如这就造成了灭活不彻底的问题。

　　2.2.2免疫应激问题 由于组织病料中含有大量组织破碎后形成的物质，经过滤后并不能完全去除这些物质，打入动物体内会造成较大应激。免疫时，抗原的剂量必须符合一定的要求，而自家苗中的抗原量无法准确确定，抗原量太少，则无法有效的产生抗体，还有就是：抗原量的含量不符合要求(太多或者太少)都有可能造成免疫耐受。自家苗中含有的抗原种类很多，这样将会使机体在一定时间内处于强免疫应急状态，导致机体对其他病原体的抵抗力下降，造成其他疾病的暴发。

　　2.2.3免疫效果问题 自家苗的质量不能得到很好的保证，无法准确的测量出疫苗中抗原的含量。病猪的病变组织中病原的含量存在着很大的变异范围，即使是同一头发18小时之后收毒测毒价，若毒价很高，便可以此作为种毒进行细胞传代和放大培养。

　　当病毒培养到一定量时，便可反复冻融细胞三次，使得细胞内病毒释放，无菌收集从培养细胞中所释放的病毒液置于500毫升无菌葡萄糖瓶中，以0.5%甲醛灭活约48小时，之后测抗原量，并以灭活48小时之后的病毒液接上细胞再次培养并做相关灭活安全性检测，当验证已灭活彻底且抗原量达标病猪只，由于感染的病原体的类型不一致，不同的组织、不同的器官，其病原体的含量也存在着很大的差异。例如：PRRSV在肺部的含量较其他器官多：而CSFV因其具有嗜内皮细胞的特性，因此CSFV在肾脏和免疫器官中的含量较多。正因为如此，如果把病猪的所有器官和组织一起捣碎制苗，各种抗原的含量都被稀释，稀释后的抗原含量很难达到有效免疫的抗原量。基于此种原因，用病猪病变组织制作的自家苗，其免疫效果存在着很大的不确定性。一方面无法确定该疫苗能否对被免疫的动物产生足够的有效保护力;另一方面，自家苗使用之后，其典型的病变就会趋于一致，造成发病猪缺乏典型病变，不能准确判断疾病类型，取这样的组织制备出来的自家苗的质量存在着很大的问题，即不同批次的疫苗之间的质量存在很大的不确定性。

　　在使用疫苗的间隔期，可能会产生抗药性改变的问题，特别是在自家苗的制备过程中并没有进行严格的控制与管理，使得疫苗在质量和安全性上存在着很大的危险性，其使用结果令人堪忧。特别是对于某些疾病可以通过进行基因交换恢复毒力，使得自家苗失去了该有的作用;还有就是，这样滥用自家苗可能会造成新型病原体的产生，使其侵入动物机体，导致自家苗完全失去其作用。

　　2.2.4应用范围问题 自家苗是取自己猪场的发病猪中分离到的病原制成的疫苗，有因地制宜的效果，自家疫苗仅供自己场内在遇到特殊疫病时使用。因此，自家苗的生产、使用区域以及使用时限都存在很大的限制性。

　　3讨论

　　从欧美畜牧业发达的国家对于疾病的防控历史情况来看，他们在畜牧业发展期间也曾经使用过自家苗的免疫，其中有成功的经验也有失败的教训。由于现在国内动物疾病的临床症状越来越不典型，而某些使用自家苗的猪场免疫效果又很不稳定，并且自家组织苗抗原的免疫原性也很不确定，同时还由于很多自家苗都是在非常简陋的情况下制作出来的，存在很大的危险。所以，现在国内很多有远见的专家学者对自家苗的态度发生了根本的变化，主张并呼吁各单位和各养殖场停止自家苗的研制、开发和临床使用。这需要政府的强力支持和养猪者思想的转变。

　　同时，自家疫苗是针对自己猪场疾病病原的血清型而分菌或(和)分毒制造成的疫苗，这种针对本场病原血清型的自家疫苗免疫在一定程度上确实起到了很好的疾病抗感染效果，这样在各养猪场自家疫苗的生产又无法在本猪场被控制和制止。所以对于自家苗的研制、开发和临床使用，政府无论是制止还是正确的引导，这都不是一朝一夕所能完成的事情。

　　目前，国内动物疾病的发生由以前的单一性疾病向混合型感染发展，既有细菌之间的混合感染，又有病毒之间的混合感染，还有细菌与病毒的混合感染，不管是哪一种混合感染，都有逐步加剧的事态，鉴于这种情况下，国内自家苗的使用越来越白热化。从短期效益来看，自家苗在一定程度上缓解了猪场疾病的发展，而从长远设计来看，自家苗的使用不利于养殖业的长远发展。

　　即使要使用自家苗，必须要从自家苗的制作技术上和临床使用上进行严密监控，严把质量关。通过组织各方面的力量来宣传自家苗的害处，从长远之计不利于养猪业的发展的势态来看，必须要改变养殖业者的思想，并且建议养殖业者在使用自家苗的同时，必须进行全套的免疫程序对猪场猪只进行免疫，丝毫不能马虎。给猪只提供全套免疫的同时，逐步减少自家苗的使用次数，以达到完全脱离使用自家苗的目标，给养猪业的发展扫平障碍。