公猪精液保存的研究进展

林永利1，2，薛永柱2
（1.福建农林大学动物科学学院，福建福州 350002；
2.永诚畜牧有限公司种猪场，福建福清 350319）

      摘要：本文阐述了近年来公猪精液的常温保存和冷冻保存两种精液保存方法的研究概况，比较了两者的优点和缺点，并提出了将来此项研究工作的一点意见。

关键词：精液；常温保存；冷冻保存

      我国自1950年以来，猪的人工授精技术已经渐渐地普及开来，经过不断的研究，目前此项技术已较为完善，大大提高了公猪的配种效能，加速了改良品种的增殖，并且在一定程度上防止了疫病的传播[1]。

      人工授精技术之所以能够得到如此广泛的推广与应用，这当中自然离开不了精液保存技术的研究与发展。一般来说，公猪精液的保存方法分为常温或低温保存和冷冻保存两种。我国对公猪精液保存的研究已经逐渐成熟。据1976年资料统计[1]，广西、广东、上海、江苏、山东、陕西、北京等地有近百万头母猪接受了常温保存精液人工授精，受胎率达到了80%；1986年，广西、北京、四川、黑龙江等6个省市的统计数字表明[2],冷冻精液累计配种母猪6万余头，第一情期受胎率达70%以上；2003年，李青旺等[3]经研究获得了53%的公猪冷冻精液冻后活率。本文将结合近年来国内外关于公猪精液保存的最新研究成果，详细论述公猪精液的常温保存和冷冻保存两种保存方法的研究进展。

1 常温保存

1.1 操作方法

      精液稀释前，多用纱布将精液的胶状物质过滤掉，由于精液包含精子和精清，精清中的电解质成分会促进精子早衰[4]。周歧生等[5]实验表明，精子采出后立刻稀释，或者静置0.5h和1.5h后再稀释，精子的抵抗力和保存效果均不如静置1h后稀释的效果好，可见精清对精子的影响有好有坏，关键是要控制好静置的最佳时间。另外，有人利用离心的方法将精清与精子分离后再加入稀释液，此方法比未经处理的精液的受胎率提高了61%[6]。

1.2 保存温度

      研究表明[7]，在精子体外存活的环境因素中，温度相当重要，较低的温度能够降低精子的能量消耗和有害代谢物生成。但许多研究人员对温度的要求有着各自不同的观点。周歧生等[5]认为8℃～10℃对保存精子有利，而12℃～15℃温度则稍高，有利于细菌的繁殖。霍秀香[8]在猪精液保存方法试验中发现，梅山猪、约克夏猪精液保存15℃极明显好于10℃、20℃、25℃。董载勇等[9]的配方筛选试验也显示了在16℃～18℃恒温保存时，精子的总存活时间和生存指数都较好。Verno Pursel(1979)则认为15℃以上的贮存温度能够很好地保存精子的受精力。目前，大量有关温度影响的试验仍在不断进行，所以如何寻找一个适宜精子生存和保持其受精力的温度，成为今后研究的一个方向。
1.3 稀释液配方

      稀释液的配方一般要满足以下几点要求：1、对精子无侵害作用；2、能供给精子营养；3、酸碱环境适合精子生存；4、渗透压适当；5、原料价格合适、配置简便[10]。

      稀释液的配方成分一般为葡萄糖、EDTA、卵黄、抗生素、碳酸氢钠或者柠檬酸钠和某些添加剂。有研究人员[5]认为用蜜糖代替葡萄糖效果更好，这是由于蜜糖中含葡萄糖、果糖、蔗糖和其他营养成分，并且有抗菌效果，价格低，蜜源丰富。EDTA是稀释液中相当重要的一个成分，它是一种螯合剂，能够与稀释液中的Ca2 +等有害金属离子结合成稳定的络合物，增加精子的存活率[5,11]。碳酸氢钠或者柠檬酸钠可用来调节精液的PH值，研究发现[5]PH在5.8较适宜，因为精子本身PH值在7.0～7.5之间，为弱碱性，只有在弱酸性的环境中才能降低其代谢率，延长其寿命。稀释用水一般为双蒸水，但是它费用昂贵，季本林等[12]进行了用自来水、自制双蒸水、天然降水、井水等来充当稀释用水的实验，结果发现天然降水（煮沸沉淀时24h的上清液）做成的稀释液与双蒸水的效果差异不显著，精子存活率、受胎率及产仔数均未下降。

      此外，稀释液中一定的渗透压是维持精子存活的必要条件，猪精子可耐受的渗透压为240 mosM～380mosM，稀释液的渗透压主要由非离子物质(如葡萄糖等)维持[11]。精子对一定范围以内的渗透压都能适宜，但在其他条件都相同的情况下，精子更适应高渗透压，因为较低的渗透压更容易破坏精子的顶体。

1.4 稀释液中的添加成分

      精子呼吸代谢能产生活性氧族(ROS)，携带有氧自由基，造成过氧化损伤,这是受精能力下降的重要原因。因此添加抵抗自由基的成分是十分必要的[11]。半胱氨酸、维生素E均有抗氧化的功效。近来研究发现褪黑激素有较强的抗自由基的作用，还可增加谷胱甘肽氧化酶的活性,还可通过对调节抑制基因bel-2的调控作用而控制细胞程序化死亡，延缓精子的衰老。马忠兰[13]在稀释液中（葡萄糖、柠檬酸钠碳酸氢钠、EDTA钠、Tris，柠檬酸、半胱氨酸,BSA）加入1×105mol/L的褪黑激素，使精液保存时间延长至6天。钱盾元等[14]将精子置于0℃冰箱内低温保存，在基础液中加入低温保护剂（4%的卵黄和2.5%的脱脂鲜奶），保存效果比不添加低温保护剂平均高了120小时，说明卵黄和脱脂鲜奶同时使用，能在低温下对精子起到保护作用。

      精子在采集和保存的过程中，不可避免地会受到一些污染物的影响，用青霉素、链霉素或者庆大霉素添加于稀释液中，可以提高对有害细菌的杀灭能力，从而提高了精子的保存活性。
2 冷冻保存

2.1 原理

      在超低温下，精子的代谢完全停止，但是在恢复常温时，又可恢复活性，这就达到了长期保存的目的[15]。精子在高渗的稀释液中，细胞体内的水分流向细胞外，同时高渗液进入精子细胞体，达到使精子脱水的目的，而后冷冻过程适当控制降温的速率，使精子细胞很快越过大的冰结晶阶段，进入微结晶，让冰晶对精子细胞的损害程度降到最低[16]。

2.2 操作方法

      冷冻方法分为颗粒法冷冻和细管法冷冻，这两种方法各具优缺点，但细管法较受欢迎，它不仅解冻后精子活力较颗粒法高，而且易操作和卫生。周佳勃等[17]实验表明，细管法冷冻猪精液的精子活力比颗粒法提高6个百分点。

      冷冻精液制作过程中必须提高滴冻速度，缩短滴冻时间，以使精液快速通过危险温区，从而提高冻精解冻后活率。因此以数分钟或数秒钟做快速降温比较有利，当每分钟降温45℃～60℃时，精子的活率比每分钟降温10℃提高了80%～90%。李青旺等[3]研究的始冻温度为-135℃，热平衡温度和入氮温度为-132℃，熏蒸温度为-108℃～132℃，其滴冻时间为50s，熏蒸时间为250s，热平衡时间为50s左右。从精子冻后活率有相当一部分达到0.5以上，是较为理想的结果。

2.3 稀释液的配方

      一般来说，冷冻精液稀释液的配方没有比较统一的成分，但是一般都含有糖类（葡萄糖、蔗糖、果糖或乳糖）、缓冲液（柠檬酸、磷酸盐）、营养成分（卵黄）、抗生素（青、链霉素）及钙离子和金属离子。有人认为[3]乳糖作为稀释剂的效果比蔗糖和果糖好其中要注意的是，葡萄糖浓度不可过高，否则对精子顶体有损害作用。Tris是一种良好的缓冲物质，添加Tris液(三羟基-甲基-氨基甲烷)可以使稀释液pH稳定，能提高精子的存活水平[17]。

      在精液冷冻过程中，要加入冷冻保护剂，一般为甘油，甘油作为冷冻保护剂时猪精子的冻后活率明显优于二甲基亚砜和乙二醇，但是乙二醇对精子的顶体有较好的保护作用，甘油却会导致顶体膜损伤和改变顶体膜的穿透能力，从而影响猪精子的受精能力[3]，可见不同的保护剂各有优势所在，日后的研究工作中应当进一步寻找更适合的冷冻保护剂。另外，瑞典的艾因阿森证实，奶类中的白蛋白能够附着于精子表面形成保护层[18]，因此，把奶类作为冷冻添加剂也是可行的。

2.4 解冻方法

      精液解冻时分为干解法和湿解法，周佳勃等[17]认为，湿法解冻效果更好；但是李青旺的实验结果表明[3]，干解法后的精子活率高于湿解法的精子活率，并且差异显著（P<0.05），此结果与徐章龙[19]、郭年潘[20]的实验结论一致。

2.5 解冻液配方

      解冻液的成分一般为葡萄糖、蛋黄、双蒸水、青链霉素及添加剂。解冻液如果仅维持生理渗透压和pH值不足以保持精子的受精力，当解冻液所含各种电解质的浓度几倍于冷冻液中的浓度时，解冻的效果好。有人在解冻液中同时加入BSA(牛血清白蛋白)和咖啡因,取得了很好的解冻效果;并且在解冻最佳温度的实验中发现用50℃水浴解冻精子的活力(46.3±2.6)%显著高于39℃水浴(42.9±2.6)%和70℃水浴(41.1±5.7)%解冻的精子[17]。

3 两种方法的优势与不足

      这两种保存方法各有优势，常温或低温保存操作难度相对不大，对设备要求较为简便，能节约成本，受胎率高，但是保存时间只有2-3天。冷冻保存的保存时间长，能够最大限度地延长公猪的配种时间，即使在优良品种的公猪死亡以后，依然能利用其精液继续繁殖，在品种基因的保留上发挥了很大的作用[2]，但是一般情况下，精液在冷冻和解冻的过程中极易受到损伤，精子的活力与原精相比明显降低，即使以较好的解冻速度解冻后仍然只有极少数能够恢复活力，解冻后存活率也只有50%左右，并且冷冻精液对设备和操作工艺要求较高，受胎率也较低[15]。

4 展望

4.1 研究出一种准确评价精子功能的方法

      常用的精子功能检测指标有质膜完整性、顶体完整性、线粒体活性、运动能力、尾部细胞质滴分布、获能率和与卵结合能力等。检测方法主要是利用光学显微镜、荧光显微镜和流式细胞计数仪等，通过应用常规染料和荧光染料、热耐受测试、低渗膨胀测试和精卵结合实验等,分析精子的形态和功能。但是目前还没有单独一种体外分析方法能准确评价精子的功能。常常要好几种指标同时测定才能较为准确地判定,比较费时、费力，费钱。若能研究出一种准确评价精子功能的方法,将为研究精液保存工作的开展提供极大的方便。

4.2 使保存精液的操作程序标准化

      虽然许多资料对于精液保存的操作方法都进行过报道，但是在常温保存温度、稀释液配方、冷冻及解冻的操作方法和期间的温度控制等方面，各种观点意见均不太一致，希望今后能进一步深入研究，弄清冷冻过程中精子内部物质发生的变化，探讨影响猪精子冻后存活的内外因素，以期能够创造出更有效的精液保存方法，使保存精液的操作程序标准化，从而提高人工授精技术的首要环节——精液保存的水平。
 
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