稀释公猪精液的品质控制

      任何人工授精公猪站都应该定期对稀释精液单剂进行品质监控，可以通过内部品控程序，也可委托第三方组织进行，以期保证精液的授精能力，让情期中按正确的时机授精的后备母猪和经产母猪都能妊娠。品控程序应该对每剂精液的精子细胞数量、精子活力、精子形态进行检测评估，并对可能存在的微生物污染情况进行排查。

      过去l5年北美养猪业人工授精(AI)技术的应用推广迅速。各个育种公司在美国和加拿大的战略位置都设有人工授精公猪站，以便能够向所有养猪生产者销售他们的种质资源。向母猪场引进新的种质资源的最简单的方法是选定一个遗传品系，从公猪站购买其稀释精液用于人工授精。

      育种公司公猪站提供的稀释精液对母猪场繁殖性能改进的贡献基本上在50％左右(Althouse和Galligan，2006)。

      本文的目的是对公猪站应该进行的稀释精液品控(QC)分析进行综述。稀释精液单剂被养猪生产者用于生产，应该具有良好的品质，在合适的时间授精后可以让后备母猪／经产母猪受孕。

      对稀释公猪精液进行品控的原因及检测项目

      1．保证精液产品拥有下列特性，可用于授精：

      无传染病原一疾病

      拥有最长的存放寿命

      获得最大的受胎率

      要想获得这些特性，公猪站必须定期对稀释精液单剂进行品质监控。可以通过内部品控程序，也可委托第三方组织进行。

      2．根据行业标准，需要对精液单剂进行检测的特性包括：

      精液单剂容积

      精子活力

      精子形态学参数

      精子浓度

      每剂所含精子细胞数(Althouse和Galligan，2006)

      委托第三方进行品控分析的好处是这样得出的结果更加客观。

      品控试验步骤

      1．试验样品数以及试验频率

      进行试验的样品(管装、瓶装或袋装)必须随机抽取，试验样品的数量取决于公猪站每天生产的精液剂量数(批数)。从统计学的角度来看，对于每天生产大量批次优质精液的公猪站，每200批就应该进行l次品控检测评估。对于每天只生产少量批次的公猪站，应该在生产200批精液的阶段当中随机抽取样本进行试验。在每200批精液当中，95％的置信区间内获得5％和l0％流行病检出率的样本水平分别是51和27(Althouse和Galligan，2006)。

      从实践的角度来看，公猪站最好定期对稀释精液产品进行试验。有些公猪站与品控试验室合作，每年订好计划，每隔l周、2周或4周进行1次试验。这样可以对精液产品的各个方面进行周期性的监控，公猪站的任何变化都能在样本试验当中反映出来。例如，公猪站人员、饮水净化系统、卫生、精液采集规程、采集设备以及精液处理，等等，这些都能在精液样本试验结果中反映出来。

      2．运输

      b决定送样本到品控试验室进行试验之后，样本应放在双层聚苯乙烯泡沫塑料保温箱当中，同时放入l7℃的凝胶冰袋，让送检样本保持在正确的温度。样本要以快递方式连夜送达目的地。基本上，送检样本的运输方式应该与给一般客户送交精液的运输方式相同。

      3．精液温度

      样本一到实验室，就应立即测量温度，利用合适的仪器，例如红外线温度计(图1)。到达时最理想的温度是16～18℃。测量温度可以确定公猪站所采用的运输措施能否维持精液的适宜温度，是否需要改变操作规程。温度十分重要，一定要记住，高于或低于16~18℃范围的温度会影响精子细胞，这样的精液在使用中会造成繁殖问题。

      4．单剂容量检测评估

      为了确定每剂精液的容量，每个容器都要用高精度天平进行称量(图2)。1 g重量可看作等同于l ml精液。养猪业人工授精采用的精液单剂容量在60—80 ml之间。各个公猪站都尽量采用相同的单剂容量，也就是80 ml。

      5．精子细胞个体活力

      通过个体精子活力检测来确定每剂精液当中的有效精子个数。进行这种检测最理想的方法是，采用一种客观的工具，让这种工具来告诉我们有活力的精子细胞的比例。现在市面上已经有计算机辅助精子分析(CASA)系统，例如SpermVision。这套CASA系统采用一台三目显微镜对精液样本进行分析，显微镜上有一个照相机，照相机与计算机连接。SpermVision的照相机可以在0．5 S之内对样本视野进行30张连续高速摄影，在这样的时间间隔下，计算机可以通过头部尺寸识别精子，并对精子的移动式样进行检测评估。通常每个样本选7个显微镜视野进行检测评估，这样就能保障分析结果准确。每个样本当中有活力的精子比例至少要达到70％。最理想的情况是样本中所有的精子的运动轨迹都呈直线，这个参数称为“向前活动力”

      通过直线运动活力精子个体比例的检测评估，可以帮助对样本中精子膜系统的完整性以及精子细胞形态的完整性进行预测(Barth，1997 )

      6．样本当中精子细胞的总数及浓度

      第一步是计算稀释精液中精子细胞的浓度。由于精液单剂当中精子浓度很高，因此有必要先按一定比例对单剂进行稀释，以便可以通过肉眼对精子细胞的个体进行计数。然后将稀释精液置于血球计当中，通过相差显微镜对精子浓度进行检测评估。然后利用已知公式，根据稀释倍数和细胞计数结果对精子浓度进行计算。这项技术可以说是计算每毫升溶液当中细胞浓度的黄金标准。

      然后用血球计计算得出的每毫升浓度乘以单剂容量，即可得出单剂总精子数。

      除了按照上述步骤进行逐步计算之外，也可以利用一套CASA系统对精子浓度进行测量。SpermVision系统就可以对每毫升精子浓度进行测量，同时对精子活力进行评估。在最终样本报告中，该CASA会给出精液单剂当中的总精子数。

      SpermVision CASA系统的一大优点是，在对精子浓度进行计算的时候，可以和血球计结合在一起同时使用，在计算机的帮助下捕捉个体精子的形态，并进行相应计算。

      7．精子形态学评估

      1)整体形态

      对样本中精子的总体形态特征进行评估，并寻找异常精子。这种方法对于来自多头公猪的混合稀释精液尤为常用。利用显微镜在低倍(20X)物镜下观察精子的形态学特征，对正常和异常的精子细胞进行计数。用这种方法可以发现的异常包括头部异常、尾部异常、原生质滴，以及头部断裂。这种技术无法检测顶体、DNA、液泡等方面的形态学异常，要检测这些异常，需要高倍显微镜放大，并要求对细胞进行染色。

      整体形态学检测评估可利用某种CASA系统来完成，例如SpermVision

      (2)细微形态

      在亮视野显微镜下观察，精子细胞呈半透明状，因此要想进行细致、彻底的形态学检测评估，就需要采用特殊的显微技术或染色技术，尤其是怀疑受胎率受到了影响的情况下。湿片镜检时，在载玻片上滴一滴稀释精液，再滴上一小滴戊二醛来限制精子细胞的活动，然后加上盖玻片。对精子细微形态进行检查时，需要使用1000倍油镜，并结合采用特别的显微光学技术，例如相差显微或微分干涉差(DIC)显微(Barth和Ok0，1989)。

      精子细微形态学检查的另一个方法是，用稀释精液做成抹片，用伊红-苯胺黑染色，然后再用l000倍油镜在亮视野或相差显微镜上观察(图7)

      不论采用哪种方法，在形态学分类检查中都至少要对每个样本计数100个精子细胞。检查的分类项目取决于检查者所受过的培训，以及他／她进行这种检查的能力。总的说来，精子细微形态学检查的基本分类包括正常细胞、头部缺陷、尾部缺陷，以及原生质滴。不过，分类项目也可以扩展，包括顶体缺陷、头部断裂、中段缺陷、近端小滴、远端小滴、畸形细胞、存在其它细胞，等等。

      8．精液细菌学培养

      公猪射精收集来的精液出现菌精症的情况非常普遍，也就是精液被细菌污染(Althouse和Lu，2005 )

      尽管公猪的繁殖管道当中没有细菌，但经过射精和采集之后，精液可能会遭到严重污染，每毫升当中含有102—106个微生物(De Grau等人，2006 0精液细菌污染的主要来源是公猪，但也包括其它来源，例如猪舍环境、猪舍工作人员、实验室工作人员，以及稀释精液用水的水质(Althouse和Lu，2005 )精液污染通常发生在采集过程中，因为此时精液与包皮液、粪便、被毛和皮肤距离很近。在精液采集、处理和稀释过程中，人手和设备的卫生与精液污染也有非常重要的关系(De Grau等人，2006 )

      公猪精液里出现的细菌污染主要来自肠杆菌科的细菌。根据文献报导，精液污染当中出现最多的细菌有肠球菌属(20．5％)、嗜麦芽窄食单胞菌(15．4％)、木糖氧化产碱菌(10．3％)、粘质沙雷氏菌(10．3％)、鲁氏不动杆菌(7．7％)、大肠杆菌(6．4％)、假单胞菌属(6．4％)以及其它种的细菌(23．0％)(Althouse和Lu，2005 )最近关于公猪精液当中的细菌进行了一项回顾性研究(表1)，研究的精液来自加拿大全国12家公猪站，由3家不同的实验室检测，结果发现最常见的细菌包括假单胞菌属(25％)、不动杆菌属(9．7％)、大肠杆菌(6．4％)、链球菌属(6.4％)、柠檬酸杆菌属(6.4％)以及腐败希瓦氏菌(3．2％)(De Grau等人，2006 )

      稀释精液一旦被高浓度的细菌污染，就会影响受孕率、妊娠率，并缩短精液单剂的有效贮存时间。菌精症会降低精子活力，破坏顶体，造成精子细胞死亡，从而降低精液品质。用污染精液授精可造成母猪官颈脱垂和子宫内膜炎。因此，一定要向公猪站的工作人员强调卫生的重要性，在精液采集与处理的过程中遵守卫生规程。同时，还要对实验室设备与设施采取严格的清洗消毒措施，同时，可在稀释精液中加入抗生素，保护精子细胞(DeGrau等人，2006)。

      鉴于菌精症的风险，公猪站最好对采集的稀释精液实施品质控制，对细菌污染情况进行检测。取每个稀释精液样本，用微生物接种环接种到5％血琼脂平板培养基上，在37℃条件下培养至少24 h，对微生物污染情况进行检测。

      理想结果是培养后没有发现任何微生物污染(图8)(Reicks，2003)。

      假如任何一份稀释精液样本当中发现有细菌生长(图9)，那么就需要对细菌种类进行鉴定，并进行药敏／最低抑菌浓度(MlC)试验，以便确定采用何种抗生素来控制这种微生物(Reicks，2003)。细菌的鉴定以及抗生素药敏／MIC试验可由专业兽医试验室来完成。

      同时，公猪站自己的实验室也要进行稀释精液品控。公猪站的实验室需要定期针对微生物进行排查、培养，以便对微生物分布的情况进行监控(至少每月l次)，这一点非常重要。需要进行采样培养的区域包括那些精液与稀释剂经常接触的区域，以及温暖、潮湿的区域，比如供水系统、转移水和稀释剂的容器、吸液管尖端、稀释剂桶、集精杯、培养皿、水浴池、保温箱、切片加热器，等等(Reicks，2003)。

      精液样本当中的细菌鉴定出来之后，有时有可能根据鉴定结果推测出可能的污染来源(表1)。

      加拿大Minitube公司2007年从加拿大全国的公猪站接收精液样本进行第三方品控检测。在所有收到的样本中，449例样本要求进行细菌学培养。在这449例样本当中，157例(34．96％)用10 u l无菌接种环接种之后每个培养基生出l个或更多的菌落(CFU)，45例(10．02％)生出>5 CFU，这意味着每毫升稀释精液的细菌含量>500。由于细菌含量很高，这45个精液样本被送往实验室进行细菌鉴定和药敏试验。这45个样本中有38各检测到了细菌污染，其中有些样本污染了一种以上的细菌。表2对鉴定到的细菌及其分离频率进行了总结。

结论

      对公猪站生产的精液进行定期品控检测是一种卓越实践，有助于对公猪站的精液采集、检测、处理、包装和运输技术进行监控和改进。同时，这样也可保障精液产品的质量，让母猪场放心地将这些精液产品用于人工授精。