猪的冷冻精液技术研究进展

      猪冷冻精液技术是指利用干冰（-79℃）、液氮雾等作冷却源，将精液特殊处理后，保存在超低温的液氮（-196℃）状态下，达到长期保存的目的，并且解冻后输精的过程。自Polge等1956年开始猪的冻精研究试验以来，许多国家相继开展了此项技术的研究，目标是提高它的繁殖成绩，达到现场生产可接受的水平。我国养猪业已从传统的副业型转变到效益型、专业化的瘦肉产品生产，猪的常温液态保存精液技术已经被大面积地推广和应用到养猪生产实践中。精液冷冻保存是人工授精的一项重大变革，不但解决了精液长期保存的问题，有利于本地猪种资源保护，还使精液不受时间、地域的限制，便于开展省际、国际之间的协作，提高优良种猪的利用率；而且极大地延长了种猪基因物质的使用寿命，使优良种猪在短期进行后裔测定，保留和恢复精液供应、血统更新、引种、降低生产成本等方面均有重要意义。随着全国性、区域性种猪联合育种工作的深入开展，猪的冷冻精液技术研究越来越显得迫切。

一、猪冷冻精液技术的现实意义和局限性

      与猪的常规温度（15℃～17℃）液态保存相比，猪的冷冻精液技术具有以下现实意义和局限性：

      1) 由于冻精可以使优良基因得到无限期的保存（如本地猪种资源保护），延长公猪使用年限，而不受该公猪死亡、损伤、采精间隔或繁殖不育的限制，有利于人为地使用高性能水平的种公猪与较多数量的母猪配种，获得更大的遗传进展；

      2) 使种猪选择扩大到世界范围的各群体进行成为可能，不受时间或地理位置差异的限制，引进国外高性能公猪冻精取代进行活体公猪，可节省外汇支出；

      3) 有利于人工授精体系的完善，公猪冷冻精液可以在后裔测定或疾病检测后才开始大量供应，为稳定的遗传进展和严格的生物安全提供额外保障。从健康角度考虑，冻精为疾病检测提供了足够的时间，冻精还为大型的人工授精站暴发疾病时提供了稳定的精液供应保障。
当前，猪的冻精应用估计占世界人工授精不到1%的比例(Wagner and Thibier 2000)，这个比例在许多年里都没有大的变化(Reed 1985,Almlid and Hofmo 1996)。

      4) 冻精没有得到大面积的主要原因是繁殖成绩不理想。与常规液态保存精液相比较，分娩率为40%～70%，低20%～30%，窝产仔数为7～10头，少2～3头（Johnson 1985,Almlid and Hofmo 1996）。

      5) 冻精的体外活力和解冻后受精能力在不同的种公猪个体之间存在很大的差异。

      6) 液态保存精液每剂只需要20～30亿精子数，而冻精每剂需要更多的精子，一般为50～60亿。

      7) 成本高，从工作量和实验室设备考虑，冷冻和解冻是一个耗费资金的过程。

      8) 需要可靠的实验室设备以供准确测试精液质量，最大的问题是解决体外精子的活力与其实际的受精力、受胎效果的相关性。

      9) 把握适时输精的时机。冻精输入母猪体内后的理想受精时间比液态保存精液大大缩短了。

      因此，继续改进猪精子的冷冻和解冻操作方案仍是养猪业面临的一个课题。猪精子与其他家畜相比，有许多不同之处。它一次射精量大，采精后对外界温度的突然改变相当敏感（所谓的“冷休克”反应）。冷冻精液技术的成功与否，关键在于对影响猪精子在冷冻和解冻过程中失去活力、保持受精能力等多因素的理解和监控。这些因素包括外界因素、精子本身生物学特性、种公猪个体差异和每次采精的质量差异。外界因素有稀释液的组成成分、抗冻剂选择及其浓度、稀释比例和冷却或缓冲速度、冷冻和解冻所采取的方法(Johnson et a1 2000)。遗憾的是我们只能通过改变外界因素来优化冷冻精液操作过程和提高繁殖成绩。

      为了适应猪肉的高效、优质生产需要，全世界的种猪都在不断地被更高遗传水平的群体所更新，在一个国家或地区范围内，采用保存3～5天的液态精液或者活种猪进行遗传物质传递已经足够，但从我国幅员辽阔的地域、种猪的跨国家贸易和在遗传交流时减少疾病传播的角度考虑，猪的冷冻精液技术需求非常迫切。

二、猪冷冻精液技术研究简史

      1949年英国Polge等发现甘油（丙三醇）对牛精子具有抗冻保护作用，1956年开始应用这个原理进行猪精子的冷冻操作，但在1950～1960期间的研究结果中，冷冻保存、解冻后的精子具有活力，但无法获得受胎结果。虽然在1970之前有几例猪的冻精成功受胎的报道，但其结果不能被重复。1970年开始，Polge 等学者利用外科腹腔授精法将解冻后的精子直接注入输卵管而获得83%的受精卵，其后，多个研究小组如美国的Crabo and Einarsson 1971； Graham et a1 1971； Pursel and Johnson 1971；法国Paquignon & du Mesnil du Buissson 1973; 澳洲Salamon & Visser (1972，1973，1974)和德国的Westendorf et al （1975）相继报道了以常规的子宫颈输精并成功分娩的冻精技术试验结果，终于阐明低温保存后猪的精子仍具有受精的能力。从此，世界学者为了把猪的冷冻精液技术应用到养猪生产实践中作了许多努力，并对操作程序进行不断优化。迄今为止，人们仍沿用细管(Westendorf et a1 1975) 、颗料(Pursel and Johnson 1975)及其改良型保存装置进行猪精子的冷冻和保存。虽然冻精仍保持一定的受精能力，但产活仔数、受胎率等繁殖结果明显低于液态保存精液(Johnson 1985)。因此，采用长效、低成本、切合实际的液态保存精液技术得到了不断的改进，可以部分解决国际间遗传物质的交流，受胎率也很接近自然交配结果。所以，即使冻精的繁殖效果与液态保存精液达到相似的程度，也不会取代液态保存精液技术的广泛应用地位。所以，猪冷冻精液技术在未来养猪业中的普遍应用的价值仍存在不断地争议之处。

三、冷冻保存方式

      在一些早期研究中，猪的精子采用玻璃瓶(Polge 1956)或玻璃试管(Settergren 1958) 和较高浓度的甘油溶液进行冷冻保存。后来，牛的粒状干冰方法被应用到猪上(Nagase and Niwa 1963)，把甘油溶液浓度降到1~3%的范围，可以执行快速冷冻降温操作 (Purse1 and Johnson 1975)。公猪精子采用5ml大容量保存Maxi-straws (Westendorf et a1 1975), 4-5 ml 铝袋(Waide et a1 1975), 0.5 ml 中型细管Medium-straws (Fazano 1986, Baron 1986, Leps 1988), 1.7-2.0 mL 扁平Maxi-straws (Leps 1988, Moura 1988, Ewert 1988, Stampa 1989, Wegmann 1990, Simmet 1993), 和 0.25 mL 微型细管Mini-straws, 和不同类型的5 mL 塑料袋 (Larsson et a1 1976, Bwanga et a1 199 1 b, Mwanza and Rodriguez-Martinez 1993, Rodriguez-Martinez et a1 1996)。所有这些保存类型既有它的优点又有它的缺点。颗粒和0.25 、0.5 mL小型细管有较大的表面积/容量比，是适合低温冷冻保存的形状。然而颗粒的冷冻精液较难进行不同头份/来源的区别，容易造成交叉污染且不易解冻。1头份一般需要解冻10-20 根小型细管或2-3 根扁平细管，这是造成普遍推广应用的首要障碍。5 mL 的大型细管具有1头份的精子数量，但其表面积/容量比较小，限制了理想的冷冻和解冻过程(Weitze et a1 1987)。对塑料袋包装的测试结果一直表明能均匀地冷冻和解冻，并含有1头份精子数量，但其体积太大，不适合放置在液氮罐里保存，因此无法采用。虽然5 mL大型细管Maxi-straw保存精子解冻后活力略低，但在实践中易于操作，比颗粒的使用更加广泛(Almlid and Hofmo 1996), 主要原因是不会引起交叉污染和在使用现场更方便解冻。一些学者证实：微型、小型、中型细管，扁平细管和塑料袋保存的冻精样品经解冻后，比大型细管在精子直线运动、顶体完整性、活力方面均表现得更加优良(详见Simmet 1993综述)。大型细管Maxi-straw保存的精子活力低主要原因是位于细管中间的精子受冷不均匀，但从受精率考虑，活力并不是决定性因素，因为一些学者报道了大型、中型、扁平的大型细管保存的冻精受精率无明显的差异(Fazano 1986 and Stampa 1989)。尽管资料显示利用扁平细管或5 ml塑料袋保存的冻精与大型细管Maxi-straws相比有更高的受精力、输卵管富余精子更多，但这些保存方法在生产实践中均没有被推广使用(Simmet 1993) (Bwanga et a11991b)。在目前的实践应用中，仍以传统的颗粒或细管冻精为基础。

四、冷冻与解冻速率

      冷冻过程中的精子细胞不但要对保存状态的低温有耐受能力，而且要能经受从射精时机体温度到保存时的超低温度的变化而不过度降低活力，后者比前者更显得重要。每种细胞都有它理想的冷冻与解冻速率要求，Mazur et a1 (1972)给出的两条理论原则是：一、冷冻速率太慢时，要保存的细胞易受高浓度溶解液的影响而死亡或遭到破坏（称溶解液效应）；二、冷冻速率过快时，细胞内液体易导致结冰现象；解冻时的原理恰好相反。理论上讲，冷冻/冷却速率快的情况下，解冻速率也相应加快，其程度视不同类型细胞而略有差异。

      冻、解冻效果与稀释液中的低温冷冻保护剂有较大的关系。因为公猪精子对甘油（丙三醇）的浓度敏感，所以，通常采用低浓度的甘油溶液进行快速冷冻(Mazur 1977)。为了保持精子活力和顶体的完整性，理想的冷冻速率推荐为：0.5ml细管采用30°C/分钟, 3%甘油浓度 (Fiser and Fairfull 1990), 或者0.25 mL细管采用50℃/分钟, 1.5% 甘油浓度(Woelders and Den Besten 1993)。当5 ml 大型细管Maxi-straws 在3.3%甘油浓度下冷冻时，为达到最佳的解冻效果，冷冻速度应较慢，为16℃/分钟 (Pursel and Park 1985)。Fisher et al (1993)和Westendorf et al (1975)证实较快的解冻速率有利于保持公猪的精子活力，前者发现0.5 mL小型细管的适宜解冻速率是120℃/分钟，后者研究了不同冷冻速率对分别对麦管、塑料袋保存精子的影响。

      人工授精站在销售冻精时一般会提供与其冷冻过程相对应的解冻操作程序，但冷冻—解冻程序的优化一直是国际学者不断研究和更新的热点。

五、冷休克与冷冻缓冲时间

      Polge 先生早在1956就已证实公猪精子在迅速冷却时失去活力。这种现象尤其在发生在精液采集后迅速冷却至15℃、以及至5℃和0℃，称之为“冷休克”。在所有家畜中，公猪的精子对冷休克高度敏感，这可能是因为它特别的组成成分所致，主要是质膜中的磷脂和胆固醇(Watson and Plummer 1985)。公猪的精子在环境温度下用低的稀释倍数自然降温或孵育1～5小时后能增强抗冻能力(Pursel et a1 1972, Pursel et a1 1973)。基于此发现，大部分精液冷冻程序均包括一个15℃或15℃以上数小时的冷冻缓冲时间。如果在温度15℃以下之前，把冷冻缓冲时间延长到16 小时 (Tamuli and Watson 1994) 或24小时 (Zom 1987, Weber 1989)，那么冷冻后仍保持活力的精子数比例大大增加。冷冻缓冲的时间好象显得比缓冲时的环境温度更加重要(Weber 1989)，通过把冷冻缓冲时间由4小时延长到20小时，Kotzias-Bandeira （1997） 和Simmet （1993）分别检测了精子抗冷冻后的活力和体外受精能力。

六、受精能力与体外受精试验

      利用冷冻精液的受胎率低于鲜精和液态保存精液，原因是经冷冻解冻过程后的精子活力降低，能保持受精能力的有效精子浓度也明显下降(Watson 2000)，因为后者，即使输入与新鲜精液同等数量的活精子也不能获得相同的母猪受胎率。精子经受冷却、冷冻和解冻过程后，导致它在母猪生殖道的获能存活时间大大缩短(Watson 1995)。冷冻精液的理想受精时间往往在母猪排卵前的4～6小时范围内(Larsson 1976, Waberski et a1 1994)，而液态保存精液可以在母猪排卵前12～28小时范围保持受精能力(Waberski et a1 1994, Nissen et a1 1997)，时间范围还因不同的母猪个体而异(Stevenrink et a1 1997)。精子本身在保持受精能力时必须具备一定的内在特性、特征(Amann and Hammerstedt 1993)，因此，为了有效地监控解冻后活精子的有效性，冷冻程序的评价一般包括对一些精子特征的评估，如运动性、活力和顶体形态。然而，猪的体外精子质量参数评定与现场母猪受胎结果相关性却不高(Flowers 1997)。这一点并不奇怪，因为受胎是一个极其复杂的过程，包括能够达到输卵管的精子数量和与卵子结合的能力，甚至对输精后形成的精子库的所有精子特性都应进行研究。尽管如此，Rodriguez-Martinez(2000)指出通过体外受精试验、ZP-结合分析(ZP-binding assays)、精子穿透力等试验可以一定程度地预测现场母猪受胎成绩。

七、讨论

      如何将冷冻精液和新鲜精液的差距拉近？一直是全球研究公猪冷冻精液的专家们所要追求的梦想，也许在不久的将来可以成为现实。虽然制作冷冻精液的过程对猪精子的损伤很大，加上精子对冷休克的敏感性亦极高，在冷冻过程中不但损伤精子，而且对活存的精子寿命也随着减短，但是如能抓住母猪排卵的时间配冷冻精液的话，其成绩应不会太差，根据德国繁殖专家 Weberski 博士 ( 1994 ) 之报告认为最适冷冻精液授精时间为母猪排卵前 4 小时执行，如此做法可获得满意的受精率 ( 88.1% )。所以如何判定母猪在何时排卵，这一重要因素对冷冻精液的母猪受胎率成绩影响甚大。我国劳动力便宜，如能充分发挥技术工人的主观能动性，把每天的查情次数和频度适当提高，相信会取得令人满意的配种结果。

      根据我国养猪业的现状和发展趋势，同时也预示着：开展猪的冷冻精液技术研究和应用，对我国猪联合育种工作和地方猪种资源保护将具有较大的、积极的社会意义和经济意义。

刘敬顺 广东省农科院畜牧研究所