学习了！猪巴氏杆菌病的实验室诊断实例详解

2015年2月，广西桂平市某猪场爆发疑似巴氏杆菌病疫情，采集病死猪的肺脏进行细菌的分离培养与鉴定，结果分离出多杀性巴氏杆菌。结合临床症状、病理变化和实验室诊断，确诊为猪巴氏杆菌病。

猪肺疫是由多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida，PM）引起的一种危害严重的疾病，死亡率较高。该病主要引起成年猪的急性败血症，有时也可导致慢性呼吸道症状，致使猪群生长缓慢，严重影响饲料报酬。该病在世界各国广泛流行，在我国规模化猪场常有发生。本实验室采用细菌分离方法结合PCR检测方法，分离鉴定多杀性猪巴氏杆菌。

1 发病情况及临床症状

广西桂平市某规模自繁场有基础母猪400头，存栏肉猪1000头。2015年2月，陆续有100～160斤肉猪发病，出现喘气、发烧，1～2天死亡，鼻孔流白色或粉色泡沫。截止至送检时，猪场发病已有10天左右，发病率达10%。剖检发现，肺脏严重出血、水肿（图1），气管、支气管有多量泡沫状黏液（图2）。

图1 肺脏出血、水肿    

    图2　气管内有泡沫黏液

2 实验室诊断

2.1 材料

2.1.1 病料：临床送检病猪的新鲜肺脏。

2.1.2培养基及试剂：胰蛋白胨大豆琼脂培养基（TSA）、麦康凯培养基、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD，即辅酶）、新生牛血清、2× Taq MasterMixture（含染料）、dNTPs，均购自南宁天地扬生物试剂经营部。

2.1.3 药敏试验材料：多粘菌素、庆大霉素、链霉素、复方新诺明、壮观霉素、环丙沙星、诺氟沙星、恩诺沙星、阿米卡星、氨苄西林、头孢曲松、阿莫西林、强力霉素、头孢唑啉及氧氟沙星共15种药敏纸片，购自杭州天和微生物试剂有限公司为。

2.2 方法

2.2.1 细菌分离培养  在超净台中，选取肺脏病变处，用酒精消毒及灼烧其表面后，再用剪刀剪取病变组织，涂抹于TSA平板（加有5%新生牛血清和适量NAD）和麦康凯平板上，用接种环进行划线后置于37 ℃温箱中培养16～20 h，观察菌落形态，并挑取优势单菌落进行纯化培养。

2.2.2 革兰氏染色镜检  挑取纯化培养后的单菌落涂片，经革兰氏染色，显微镜下观察细菌形态特点。

2.2.3触酶试验  取洁净玻片1张，用接种环挑取纯培养后的单菌落，加3%过氧化氢溶液1滴，立即观察结果。

2.2.4细菌的 PCR鉴定

（1）引物合成。参考相关文献中的扩增引物，对分离到的疑似巴氏杆菌进行PCR鉴定。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

（3）PCR反应。反应体系（20 uL）：2 × Taq MasterMixture 10 uL，dd H₂O 7 uL，上、下游引物各0.5 uL，菌体DNA 2 uL。反应条件：95 ℃预变性5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，30个循环；72 ℃ 10 min。经1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物大小。（2）细菌DNA提取。用接种环勾取适量纯化培养后的菌落，放入加有100 uL灭菌生理盐水的EP管中，100 ℃水浴10 min，10000 r/min离心5 min，上清液即为初步提取到的细菌DNA，作为PCR反应的模板。

2.2.5 药敏试验 

挑取纯化培养后的单个菌落在TSA平板（含5%的新生牛血清）上均匀划线，随后贴上各种药敏纸片，37 ℃培养16～20小时后用直尺测量抑菌圈（测定3次，取平均值），依据药品说明书判定结果。

3 结果

3.1 细菌的分离及染色镜检

将病料接种于TSA平板上培养16～20小时后，可见灰白色、圆形、微隆起、湿润、表面光滑、边缘整齐的露珠样菌落（图3）。革兰氏染色后镜检为革兰氏阴性菌，形态呈圆杆形。在麦康凯平板上不见生长。

图3 　TSA平板上的菌落形态

3.2触酶试验

    触酶产生大量的气泡，触酶结果为阳性。

3.3 PCR鉴定

扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析，结果显示出现与预期片段大小一致的目的条带，片段大小457 bp（图4），说明分离所得细菌的PCR检测结果为阳性。

图4　分离细菌的PCR鉴定结果

1.阴性对照；2.细菌PCR结果；3.DNA Marker（DL 2000）

3.4药敏试验

药敏试验的结果如表１所示：

分离所得的菌株对头孢曲松、头孢唑啉、阿莫西林和氧氟沙星均高度敏感，对环丙沙星和氨苄西林中度敏感，对复方新诺明、恩诺沙星、强力霉素等低度敏感，对庆大霉素、链霉素等耐药。

5防治措施

5.1预防

（1）加强饲养管理。做好生物安全防控，注意保持营养的均衡，尽量减少各种应激因素，加强猪舍通风，适当降低饲养密度，避免过度拥挤，提高猪群的免疫力。猪场最好实行封闭式和全进全出管理，在每批猪全部转出后对猪舍彻底冲洗、消毒，空置1周后再转人新猪群。

（2）重视猪场环境清洁和消毒工作。猪舍和栏架应避免有尖锐物品存在，以防划伤仔猪皮肤而发生感染。轮换使用高效消毒剂定期消毒。

（3）免疫预防。定期接种疫苗。做好猪瘟、伪狂犬等基础免疫，肥猪在75日龄时做一次巴氏杆菌疫苗免疫。

（4）药物预防。定期在饲料中添加阿莫西林、黄芪多糖粉、多维，以补充营养需求，提高猪只抗病力。

5.2治疗

及时发现病猪，对猪舍及猪场走道进行定期消毒，对病猪进行隔离和治疗。

（1）全群用药：阿莫西林（饮水）+强力霉素（拌料）各3～5 g每头，连用5天；

（2）紧急免疫：全群普免一次伪狂犬疫苗，剂量加倍；

（3）病猪治疗：磺胺配氟苯尼考肌注或者使用其他高敏药物进行治疗。

采取以上防治措施处理后，猪场疫情得到控制，无猪只死亡，发病猪在一周后均康复。

6小结

多杀性巴氏杆菌是条件性致病菌，广泛存在于动物体内，在一般情况下肥壮的健康动物不会发病，只有当动物因受到各种应激因素刺激，如气候骤变、长途运输、疲劳过度、畜群拥挤、长期营养不良、环境潮湿和卫生条件差等，而抵抗力降低时，多杀性巴氏杆菌才会大量繁殖而导致动物发病。本病的发生一般无明显季节性，但以冷热交替、气候突变、闷热、潮湿多雨时节多发，疾病的发生往往与养殖密度呈正相关。

由于从病料中分离出的巴氏杆菌对很多抗生素都具有耐药性，加大了该病的治疗难度，加上抗生素在引起病变的肺脏中很难达到抑菌浓度，导致临床上用抗生素治疗巴氏杆菌的效果不理想。所以在实际养殖工作中应重视防重于治的理念。

临床中，常见巴氏杆菌与链球菌或其他病毒病混合感染，从而加大治疗难度、增加治疗费用，且难以成功。而且，巴氏杆菌有多个血清型，且各血清型之间不能产生完全交叉保护。因此，在巴氏杆菌多发时期（6～9月份）和常发猪场，有必要把猪巴氏杆菌病的免疫纳入正常的免疫程序。

作者：张淑云 方奎