猪场传染病的早期预警与清除技术

积极检测早期预警‍

人们意识到发生重大传染性疾病时，往往是猪群大规模暴发疾病的时候。根据流行病学原理，假如某病的流行曲线只有一个高峰，且所有病例都集中在该病的常见潜伏期内，据此可判断此次感染属于同源性传播。所以很容易推断出：病原是在之前的某个时间点（暴露日期）进入猪场，感染少量猪后，再逐渐扩散，之后可能通过“发病——扩散”的循环造成大面积的损失。

为了尽可能早地发现猪群暴露日期以便采取相应措施，人们可采取普查或抽查的方式进行现况调查（横断面调查），获得猪群患病率、症状等信息。根据流行病学原理，通过一定规律的普查和抽查相结合，可以发现早期病例、了解猪群的健康水平、了解疾病的分布。

根据家猪的生活规律可知，如果外来病毒要感染活体，必须通过口、鼻、眼、皮肤、排泄器官、生殖器官等通道进入猪的体内。具体的方式除了共用针头、配种接触、母子子宫联系、伤口接触等途径外，最大的可能就是通过口鼻感染猪的口鼻腺体，然后再进入体液循环。此外，美国专家研究表明：现有技术可以通过猪的唾液检测蓝耳、猪瘟等多种病原的核酸及抗体。因此，要对传染病风险进行早期监测，动物的口腔和鼻腔是必要的采样位点。

还有研究表明，动物感染疾病过程中，口鼻腔液、直肠液样本要早于血液样本发现病原，也就是说唾液中的病原比血液中出现得早。所以，在疾病传播的窗口期，对动物唾液、环境样本进行核酸检测对于掌握病毒传播规律十分重要。同时，一旦发现重大疾病风险，可以及时向有关部门报告，只要处理及时得当，就可以控制大部分疾病传播风险。‍

在生物隔离措施运行良好的养猪场内，最重要的监测对象是猪只及其周边的环境表面。‍

1.3.1猪只采样

对猪只采样的目的是为了评估猪只的带毒情况，一般可分为诊断采样与监测采样。诊断采样一般用于猪群发病之后的检测确诊，需要的样本一般包括：血液、肛拭子、呕吐物、流产胎儿、精液等。而监测采样的目标是监测猪群的无症状感染情况，以便兽医较早发现风险和进行干预。正确地采样对于疾病监测十分重要，监测需要的样本一般包括：唾液、口腔拭子、鼻腔拭子，其中又以唾液为最佳。早期预警的监测采样，尽量不要采血，避免造成猪群应激和疾病交叉感染。

图1 采血里人员鞋底、服装、工具都可能造成疾病交叉感染（图片引自越通社）

a) 口、鼻腔试子采样：预先在灭菌的旋盖采样管内加入0.5-1mL样本保护液，保定猪只后，将灭菌医用棉签伸入猪的鼻腔或口腔，在腔壁来回刮动，棉签粘取粘液之后，取出放入采样管，做好标记。

操作要点：最好2人协同进行，一人负责保定猪只，另一人负责采样。

优点：可以采到任何想采的部位样本。

缺点：抓猪过程、在口鼻腔的采样过程应激较大，影响猪只健康；采样人员需要进入猪栏，人员的衣服、鞋子、手套、工具可能造成病原交叉污染。

图2 猪鼻拭子采样（图片来自国家自然科学基金委员会网站）

b)唾液采样：预先在灭菌的旋盖采样管内加入0.5-1mL样本保护液，站在猪栏外面，将唾液采集袋（绳）一端绑在待采的猪只栏位上，另一端垂到猪的口鼻高度，此时猪只会主动去咬唾液采集袋，静静等待2-3分钟，提起湿润的唾液采集袋，用其自带的塑料包挤出唾液，根据需要倒1-5mL至采样管，做好标记。

操作要点：每挤完一头猪的唾液之后，更换手套。

优点：猪没有应激，还很主动；速度快；唾液量大，可同时用于多种用途；没有交叉污染风险。

缺点：采样之后的棉袋（绳）需要焚烧或其他方式灭活处理。

图3 猪只咀嚼唾液采集棉袋（绳）

图4 美国科学家使用棉绳采集唾液

1.3.2环境采样

环境采样的目的是为了监测环境中是否存在病原核酸，一般用于评估环境的安全性。采样点一般包括：人体、车辆、随身物品、下水道、料槽、地板、饲料、地面泥土、水样等。采样方式根据形态可分为以下几种：

a)干燥表面干法采样：使用干燥的灭菌医用棉签轻轻触碰采样点，并重复进行“Z”字形擦拭，棉签充分粘取采样点表面的浮尘之后，将棉签放进旋盖的灭菌采样管内，做好标记。

操作要求：保持棉签及采样管干燥。

优点：样本无需做保护处理，自然条件下可保持较长时间。

b)湿润表面湿法采样：预先在灭菌的旋盖采样管内加入0.5-1mL样本保护液，在采样现场使用干燥的灭菌医用棉签轻轻触碰采样点，并重复进行“Z”字形擦拭，棉签充分粘上采样点的表面物质之后，将棉签放进采样管内，做好标记。

操作要求：采样管内加入样本保护液。

优点：样本受到保护，可以常温保存及运输。

c)液体湿法采样：预先在灭菌的旋盖采样管内加入0.5-1mL样本保护液，在采样现场使用干燥的灭菌医用棉签轻轻搅动待采液体，棉签充分粘上液体之后，将棉签放进采样管内，做好标记。

操作要求：采样管内加入样本保护液。

优点：样本受到保护，可以常温保存及运输。‍

1.4.1核酸检测

环境与唾液样本中病毒载量少、干扰物质多，尤其是唾液中还含有多种消化酶、抗体和其他生物活性物质，导致在风险监测过程中，对唾液核酸提取和检测的要求较高。如果检测环节过多或方法不当，PCR极易出现假阴性或阴阳不定的结果，会极大地增加生产中的风险。假阴性的危害不仅是让养猪场损失高昂的检测费用，更严重是引起管理者的误判。如果猪群存在无症状感染的阳性猪而没有及时清除，则很可能会让病毒悄无声息地传遍整个猪群，等到有猪只发病时再处理可能就损失惨重了。

要准确开展PCR检测核酸，样本的核酸提取是重中之重的工作。目前市场上有两种核酸提取方式：柱提法与磁珠法。柱提法的原理是：利用硅胶膜制成过滤柱，在不同的盐浓度和PH条件下，经过3-4次清洗和过滤，将核酸提取出来供给后续的PCR操作。近年来美国科学家创新性地制造出一种纳米级的磁珠微粒，并在它表面包裹一层二氧化硅基团（SiO₂），使之在不同条件下吸附并提取核酸。

柱提法耗时较长，提取一次核酸一般需要17-35分钟不等；柱提法过滤柱的硅胶膜表面积大，对核酸的损耗较大，而且需要更换多个离心管，对环境相对不友好。相比而言，由于磁珠体积较小，磁珠法从原理上就决定了对样本核酸的损耗较少，而且它耗时短，有的产品只需要2分钟即可完成核酸提取；磁珠法所有操作只需在同一个离心管中进行，还可以使用自动化机器大批量操作，更加高效环保。更重要的是，磁珠最后可以与核酸一同进入PCR扩增环节，可以大幅减少假阴性出现的概率，这对于检测技术是一项史诗级的改变。它的缺点也十分巨大：磁珠是新兴事物，制作工艺复杂，产品以进口为主，国内生产厂家较少，进口依赖较大。

a)核酸提取：建议采用磁珠法，市场上有多种产品，成本相近的情况下，2-9分钟即可完成核酸提取；还可以使用机器批量操作，10分钟可以提取几十份核酸，效率与准确性均远超柱提法。

b)核酸检测：市场上所有核酸PCR检测试剂盒的原理都相同，不同的是各自的引物、探针、反应体系的设计存在差异，导致各厂家产品准确性和稳定性有差异。猪场的实验室最好根据自己的需求，选择几个产品对比验证后，选择适合自身的产品。

表1 研究发现唾液中比血液中更早发现病毒核酸

1.4.2抗体检测

一般认为如果没有接种疫苗，检出抗体即表明当前或过去存在感染。对于急性疾病的爆发，只有核酸检测有意义，因为大多数猪在产生抗体前已经死亡；但是如果存在幸存的猪只，特别是ASFV转变为中等毒力或者弱毒力毒株之后，则可以通过抗体检测研究猪的免疫反应。

许多疾病的抗体可以在唾液中检出，市场上有多种产品可以选用。建议猪场管理者在传染性疾病得到控制之前，不要采集血液样本检测，可避免无意间导致危险疾病在群体内传播。

图5 血液中病毒和抗体随着时间的变化及与感染不同阶段的关系（图片引自FAO ASF）‍

定点清除清理隐患‍

许多猪栏的食槽被设计成大通槽，猪圈之间的隔断被设计成镂空隔栏，这种设计不利于隔离疾病。在高度传染性疾病面前，为避免接触传播，要对这种猪舍设计稍加修改。

食槽要改成一栏一槽，猪栏之间的隔断要改成实体墙，减少猪只交换口水的概率。

图6 猪栏之间要建立实体墙（图片引自第一农经网站）

图7 猪栏之间实体墙示例（图片引自美国New Standard公司视频）

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“定点清除”要以单元格为单位进行操作，以单个猪栏为单位划分单元格。一个猪栏为基本单元格，直接与它接触的是相邻单元格，与它在同一栋猪舍及所有共用同一饲养员或有重要关联的其他猪舍都称为关联单元格。

如果在基本单元格内发现病毒，要求把基本单元格与相邻单元格的猪全部拔除，然后严格监测关联单元格的情况。

“定点清除”操作时淘汰猪就尽量从污物通道运出，如果与净物通道有重合、或交叉路段，应当与净物通道做好隔离，并在事后充分清洗消毒、采样验证。

图9 可疑猪的清除，应通过污物通道，并做好隔离和事后消毒‍

加强营养增进健康‍