运用液体通气培养方法制备猪链球菌灭活疫苗试验

运用液体通气培养方法制备猪链球菌灭活疫苗试验

 

杨涛   甘伏生 

 

     摘要：猪链球菌病是人畜共患的、由多种致病性链球菌感染引起的急性、热性传染病，其主要特征是急性出血性败血症、化脓性淋巴结炎、脑膜炎以及关节炎，发病猪群的死亡率可以达到80%以上、被列为二类动物疫病。猪链球菌还可以感染特定人群发病，严重的可导致死亡，防治该病可用猪链球菌病灭活疫苗。

 

     为了GMP车间的发展，加快工厂化生产步伐，提高产量，我们模拟了灭活苗车间制备灭活苗过程中的工艺条件和环境要求，运用液体通气培养的方法制备猪链球菌灭活疫苗，已获得初步成功，现将过程和结果报道如下

 

关键词：猪链球菌  液体  通气培养     灭活疫苗

 

     一、材料和方法

 

     1、材料

 

     牛肉购于回民食品批发市场  ；猪胃购于万吨冷库生鲜批发市场 

 

     各种化学试剂、器械等均由湖北省精牧兽医技术开发有限公司质量监察室提供

 

     猪链球菌株由湖北省农业科学院畜牧兽医研究所提供

 

2、方法:

 

     制备马丁肉汤培养基

 

⑴猪胃消化液

 

     猪胃300克  盐酸10毫升  蒸馏水1000毫升  步骤分为消化、煮沸、调PH值、过滤分装、灭菌备用

     ⑵牛肉汤

 

     牛肉500克  水1000毫升      步骤分为加热保温、煮沸、过滤分装、灭菌备用

 

     制备马丁肉汤时，只需取⑴、⑵的相同数量混合，另按每1000毫升加入氯化钠2.5克，加热至70℃左右调PH7.8－8.0，煮沸10分钟，过滤分装，116℃30－40分钟。

马丁琼脂培养基

 

      取马丁肉汤培养基加入一定比例的琼脂，调PH值，121℃30分钟，稍冷却后就可于无菌环境倾倒平皿，也可在倾倒之前按一定的的比例加入血清和裂解血

 

     二、制备过程

 

     一级种子的制备：在无菌条件下，开启冻干菌种13株，分别接种到含5－10％无菌血清马丁肉汤培养基试管中，至37℃温箱培养，作为一级种子，与此同时，对冻干菌种进行纯粹检验，将开启的菌种分别涂片，革兰氏染色镜检；然后，分别接种马丁血琼脂平板。37℃需氧培养24h后，分别挑取典型菌落涂片染色镜检，可见革兰氏阳性（紫色）短链球形或卵圆形细菌，也有单个散开或成双排列，无芽孢，有的可见到荚膜。

 

     二级种子的制备：取经纯粹检验后的一级种子，在无菌条件下分别接种到含5-10％无菌血清马丁肉汤培养基三角烧瓶中，培养基的用量是一级种子的10倍，同时接种一定数量马丁琼脂血清平皿，一起放37℃需氧培养24h作为二级种子， 再次进行纯粹检验，结果与一级种子一致，即可作为二级种子（生产用）

 

     三、通气培养

 

     根据发酵罐的构造原理，我们用血清瓶做为罐内层，加热水箱当作罐体夹套的构思，设计了试验的路线，具体方法是：将血清瓶橡胶盖上打孔二个，插入不锈钢管，两头均露出一段，一根不锈钢管的瓶外端接通纯净的压缩空气；瓶的内端连接白乳胶管直至瓶底部，胶管的远端部分钻有一定数量小孔，顶端的圆形开口封闭；另一根不锈钢管的瓶外端连接一个排气球。

 

     事先要将血清瓶和盖子等附属物件分开包好，121℃30分钟备用，配制马丁肉汤培养基装入其中，121℃30分钟，备用，将血清瓶等用品放车间物流入口，无菌处理，     人员严格按照下列程序进入：

 

     进入门厅，将携带物品（雨具等）存放于指定位置。

 

      在更鞋区脱下自己的鞋，换上工作鞋，进入一更衣室，脱外衣裤，放好，摘掉各种饰物用流动纯化水对手部进行清洁， 进入二更室更换二更洁净拖鞋，更换洁净服，戴洁净帽、口罩，将衣袖口扎紧，扣好领口，头发全部包在帽子里边不得外露。

从二更室进入缓冲间，将手伸至感应灭菌器处75%乙醇溶液喷洒消毒；（在手消毒后经洁净走道，到物流入口处，拿取物品放在操作间的物流缓冲间），通过洁净走道进入三更室，脱掉洁净工作服及内衣裤，进入盥洗室，淋浴，换上无菌内衣裤，穿上万级洁净区连体无菌工作服及洁净拖鞋，戴口罩。手部再次消毒，进入操作间。

 

     在无菌操作间，加入5-10血清于血清瓶中，加入纯粹检验合格的二级种子，扎好瓶口，拿出在发酵间运用无菌的方法，将血清瓶放置到加温水箱里，水箱的工作控制温度设定在37.5℃，无菌连接纯净压缩空气接口，微调压缩空气调节阀，看到血清瓶内有少量的小气泡产生即可， 每1小时观察记录水箱的温度，进气和产生气泡的情况

 

     18-24小时，无菌取样，涂片镜检，计数、小白鼠毒性试验、 涂片镜检：与一级种子纯粹检查结果一致，合格；

 

     细菌计数：采用10倍稀释的方法，9㎝的马丁肉汤琼脂培养基接种稀释好的菌液0.1毫升放置于37℃培养箱培养24小时，计数平皿上的菌落，达到制苗的要求；

 

     小白鼠毒性试验：腹腔内注射18-24小时的培养物0.2毫升数日内死亡，小白鼠尾巴发绀，剖检肝、脾、肺、心出血，呈败血症。

 

      灭活：用分析纯甲醛试剂，按1%的用量加入到培养的菌液中，摇动，继续放在水箱中，每隔2小时摇动一次，24小时后用平皿法和动物实验检查灭活效果，无菌生长、动物正常即可进入下一道程序。

 

     配苗：用生理盐水稀释商品氢氧化铝胶，消毒灭菌后按菌液5、铝胶1的比例混匀，分装、贴签，配好的成品，安检合格、甲醛含量合格。

     四、结论：运用液体通气培养的方法制备猪链球菌疫苗，设计思路、操作程序、制备工艺是成功的，车间生产可借鉴其过程，对指导生产有一定的实用价值。

—————————————————————————————

甘伏生、男、1960、湖北省农业科学院、技师、兽医生物制品研发