国内首株猪德尔塔冠状病毒的分离鉴定

猪德尔塔冠状病毒(Porcine deltacoronavirus, PDCoV)是尼多目(Nidovirales)、冠状病毒科(Coronaviridae)、冠状病毒亚科(Coronavirinae)δ-冠状病毒属成员。该病毒于2012在中国香港首次报到，约10%的粪便样品呈PDCoV阳性，其中对两份粪便样品中的PDCoV(HKU15-44和HKU15-155)进行了全基因组序列测定和分析[1]。美国于2014年2月在腹泻仔猪和母猪的粪便中首次检测到PDCoV，感染猪的临床症状类似于猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)感染，表现为仔猪、母猪水样腹泻和仔猪死亡，但仔猪死亡率(30%-40%)比猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起的死亡率低[2]。随后，韩国和我国大陆也从腹泻猪的临床样品中检测到PDCoV [3-5]。本实验室利用针对PDCoV 包膜(E)蛋白、膜(M)蛋白基因的特异性引物，对2014年1月至2015年11月收集的77个猪场的232份临床腹泻样品进行了RT-PCR检测，结果表明10.34%(24/232)的样品呈PDCoV阳性。目前，只有美国的两个研究团队利用猪睾丸(Swine testicular, ST)细胞、猪肾(LLC porcine kidney, LLC-PK)细胞成功分离到了两株PDCoV，并对其致病性进行了相关研究 [6-7]。我们将PDCoV阳性样品接种LLC-PK细胞并对其培养物进行细胞传代培养，通过细胞病变(CPE)、RT-PCR、间接免疫荧光(IFA)和基因序列测定对传代细胞毒进行鉴定，成功分离得到国内首株PDCoV并将其命名为NH株，该病毒的分离对进一步研究PDCoV的致病性、致病机制、诊断试剂和疫苗研制具有重要的意义。

材料和方法

1.1 主要材料和试剂

仔猪小肠及内容物采集自黑龙江讷河地区某猪场;胎牛血清、MEM培养基、青链霉素、2.5%胰酶均购自Gibco公司;QIAamp Viral RNA Mini Kit购自QIAGEN公司;PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit、EmeraldAmp PCR Master Mix、pMD18-T载体均购自TaKaRa公司;Trans5α感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司;山羊抗小鼠IgG/Alexa Fluro 488购自北京中杉金桥生物技术有限公司;胶回收试剂盒购自OMEGA公司;质粒提取试剂盒购自Axygen公司;LLC-PK细胞、鼠抗PDCoV 纤突(S)蛋白血清均由本实验保存和制备。

1.2 病毒分离和传代培养

采用RT-PCR方法对收集的病料样品进行检测，将PDCoV阳性样品和灭菌PBS按1：5的质量体积比制成悬液，振荡混匀后5 000 r/min，4℃离心10 min，吸取上清，0.45 µm滤器过滤，接种LLC-PK细胞单层，37℃ 5% CO2 吸附1 h后用灭菌PBS洗2遍，换维持液(含100 U/ml青霉素，100 µg/ml链霉素和10 µg/ml胰酶的MEM培养基)后继续培养。同时设正常细胞对照。每天观察细胞生长情况和CPE。经盲传将产生CPE的细胞及其上清液反复冻融3遍后继续传代培养，当出现90%以上的CPE时，收获病毒，并在LLC-PK细胞上连续传代至第9代(P9)。

1.3 病毒RT-PCR鉴定

取第9代(P9)细胞培养液，按照说明书，用QIAamp Viral RNA Mini Kit提取病毒RNA。取适量病毒RNA，采用PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit合成第一链cDNA。参照GenBank中登录的PDCoV HKU15-44 (JQ065042)株的E、M基因序列，利用Oligo 6.0设计一对特异性引物(EMU, 5'-ACCAACCAACACCGTCCTTTA-3'/EML, 5'-AGAACCACGAGACTGTAAGCA-3')。引物由哈尔滨博仕生物科技有限公司合成。PCR反应体系为25 µl，其中2x EmeraldAmp PCR Master Mix 12.5 µl，cDNA模板1µl，10 µM EMU、EML各0.5 µl，ddH2O 10.5 µl。反应条件如下：95℃ 5 min;98 ℃ 10 s、55℃ 30 s、72℃ 60 s，35个循环;72℃ 10 min。同时设病毒RNA对照。PCR产物经1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测。将经胶回收纯化的PCR产物克隆至pMD18-T中，重组质粒由哈尔滨博仕生物科技有限公司测序。

1.4 病毒IFA鉴定

LLC-PK细胞单层感染分离病毒 18 h后弃掉上清液，以4%多聚甲醛在4℃固定30 min，经0.2% Triton-X100在室温作用20 min，利用5%脱脂乳封闭;以鼠抗PDCoV S蛋白血清为一抗(1:800)、山羊抗小鼠IgG/Alexa Fluro 488为二抗(1:500)，进行IFA鉴定。

1.5 病毒遗传演化分析

利用Lasergene 7.1(DNAStar)软件包中的Editseq、MegAlignr软件对分离株和参考病毒株的M基因序列进行分析、比对。利用MEGA 6.06软件中的Maximum Likelihood法构建系统发育树，分析分离株和参考病毒株之间的亲缘关系。

结果

2.1 病毒的分离

将处理的PDCoV阳性样品接种LLC-PK细胞单层进行病毒分离，观察72h~96h。结果显示盲传3代后开始出现CPE，随着传代次数的增加， CPE出现时间逐渐缩短。通常在感染后12h~24 h出现CPE，主要表现为细胞变大、形成合胞体、脱落等现象(图1)。

A: LLC-PK cells infection with P9; B: LLC-PK cells with mock infection

图1 LLC-PK细胞感染P9后出现细胞病变(20 x 16)

2.2 病毒分离株的RT-PCR鉴定

利用针对PDCoV E/M基因的特异性引物对分离株P9进行RT-PCR检测，同时以病毒RNA作为阴性对照。结果显示得到一条约为1100 bp与预期大小一致的特异性目的片段，而且阴性对照成立(图2)。测序结果(KU517165)为1062bp，与PDCoV参考毒株HKU15-44(JQ065042)、HKU15-155(JQ065043)的同源性分别为99.4%、99.7%。将分离株命名为NH。

图2 NH株E和M 基因的扩增

2.3 病毒的间接免疫荧光(IFA)鉴定

以特异性的鼠抗PDCoV S蛋白血清作为检测抗体，采用IFA方法对病毒感染的LLC-PK细胞进行IFA检测，正常LLC-PK细胞作为对照。结果显示病毒感染的LLC-PK细胞有特异性免疫荧光产生(图3A)，而正常细胞未出现荧光反应 (图3B)。

A: LLC-PK cells infection with NH strain; B: Normal LLC-PK cells

图3 NH株感染LLC-PK细胞的IFA检测

2.3 病毒遗传演化分析

利用MEGA 6.06软件中的Maximum Likelihood法对PEDV、猪传

染性胃肠炎病毒(TGEV)、NH (P9代) 和PDCoV国内外参考毒株的M基因进行系统发育分析。结果表明NH(红色三角标注)和所有PDCoV参考毒株在同一群内且亲缘关系近，而与PEDV、TGEV不在同一群内且亲缘关系远(图4)。

图4 NH株和参考毒株系统发育分析

讨论

冠状病毒能够引起人、哺乳动物和禽类发病。国际病毒分类委员会将其分为α-冠状病毒、β-冠状病毒、γ-冠状病毒和δ-冠状病毒四个属，其中α-冠状病毒、β-冠状病毒属成员只感染人和哺乳动物，γ-冠状病毒属成员只感染禽类，而δ-冠状病毒属的成员能够感染哺育动物(猪)和禽类，对公共安全具有潜在地威胁性。

δ-冠状病毒是冠状病毒家族的新成员，于2009年首次在香港的野禽中被发现[8]，随后于2012年在香港的猪群中被发现[1]。美国自2014年2月在俄亥俄州首次发现PDCoV以来已经在20多个州的猪群中发现PDCoV[9]。本实验室从2014年3月起对来自不同省份的仔猪、母猪或后备公猪的腹泻病料进行PDCoV检测，发现黑龙江、辽宁、天津、山东、河北、江苏的部分猪场存在PDCoV。此外，国内其他研究人员也在江西、安徽、江苏、湖北的部分猪场中发现PDCoV[4, 5]。

2015年初黑龙江省某猪场发生腹泻，3份小肠内容物送到本实验室进行相关的病毒性腹泻病原检测，检测结果表明病料呈PDCoV阳性且无PEDV, TGEV, PoRV感染。我们将阳性病料处理后接种LLC-PK细胞并连续传代培养，分离得到国内首株PDCoV，并将其命名为NH株。同时对每一代培养物进行RT-PCR跟踪检测，从P0代到P9代均能检测到特异性的目的条带。此外，还利用PDCoV S蛋白特异性血清对NH P9代感染的LLC-PK细胞进行了IFA，能够看到特异性荧光; P9代的E、M基因序列与PDCoV参考毒株HKU15-44(JQ065042)、HKU15-155(JQ065043)的同源性分别为99.4%、99.7%。根据M基因构建的系统发育树表明NH株与PDCoV国内参考毒株和美国、韩国参考毒株在同一群内。这些研究结果进一步表明我们分离到的NH株为PDCoV。

虽然目前PDCoV的检出率没有PEDV的高且危害没有PEDV严重，但是PDCoV NH株的成功分离和鉴定对我们下一步研究其致病性、致病机制、诊断试剂开发和疫苗研制具有重要的意义。