这四个措施可以有效提高猪精液保存质量和使用效果

精液冷冻保存通常以液氮（-196℃）作为冷源，对精液进行特殊处理，通过超低温抑制精子代谢活动，使精子处于休眠状态；通过冷冻保护剂及其他技术措施（如降温速度）来降低冷冻损伤，从而实现长期保存。当温度回升后又能复苏，且具备受精能力。

冷冻保护剂是当前精液冷冻保存的必备物质，能减少精子冷冻-解冻过程产生的物理和化学损伤，分为渗透性和非渗透性冷冻保护剂。渗透性冷冻保护剂（甘油、二甲亚砜等）可与水分子结合并透过细胞膜，改变膜脂和蛋白质排布，增加膜流动性和低温脱水程度，稀释溶质浓度，减少细胞内冰晶形成。非渗透性冷冻保护剂（蛋黄、脱脂牛奶、海藻糖、蔗糖等）不能透过质膜，通过改变渗透压引起细胞脱水，在细胞外发挥非特异性保护作用。但冷冻保护剂使用浓度不当会对精子造成渗透胁迫和毒性效应。

精液冷冻技术大致可分为常规冷冻（conventional freezing）、定向冷冻(directional freezing)和玻璃化冷冻(vitrification)。

（1）常规冷冻保存技术  又称等轴冷冻（equiaxed freezing），包括手工冷冻技术和程序冷冻技术，其中手工冷冻目前应用最为广泛。通常将装有精液的0.25或0.5 mL塑料细管置于液氮上方4-5 cm处，熏蒸时长10分钟左右，然后放入液氮中储存，冷冻速率约为60℃/min。程序冷冻是利用程序降温仪控制不同温度范围内的降温或冷冻速率，其降温程序具有物种特异性。有研究表明程序冷冻法解冻后精子活力优于液氮熏蒸法。但常规冷冻方法存在冰晶形成难以控制、潜热耗散差造成反复冻融的缺点，由此导致了一种新的冷冻技术的出现，即定向冷冻技术。

（2）定向冷冻技术  使用了多温度梯度装置，精液稀释后以0.3℃/min的速度冷却到4–5℃，分装于预冷的空管中（5、8或12 mL）；然后管子以恒定速度（1.0–1.5 mm/s）通过5℃（温块）到-50℃（冷块）的线性温度梯度模块；接着将管子移至-100℃的收集室，并转移到液氮中储存。Saragusty等（2016）提出，当通过定向冷冻技术冷冻大量精液时，无需控制冰核形成。该方法具有冷却均匀、潜热耗散高效、允许冷冻大量精液、减少精子机械损伤的优点，在多种家畜和野生动物的精液冷冻效果优于常规细管冷冻法。

（3）玻璃化冷冻技术  是一种新兴的冷冻保存技术，它利用高浓度的冷冻保护剂处理精液，精液分装于细管后可直接投入液氮，与传统冷冻保存技术相比具有平衡时间短、冷冻速度快、无需昂贵设备、不产生冰晶损伤的优点。但高浓度的冷冻保护剂会对精子产生致命的渗透效应和毒性损伤，限制了其应用。研究表明，不使用渗透性冷冻保护剂对人类精子进行玻璃化冷冻是可行的，而猪、牛精子不宜进行玻璃化冷冻。

尽管定向冷冻技术和玻璃化冷冻技术有许多优点，但常规冷冻技术仍是目前世界上最常用的猪精液冷冻保存技术，并在不断改进和完善（图1）。

图1 猪精液常规冷冻技术流程图（改绘自Pezo等（2020））

AOX, 抗氧化剂; BTS, BTS稀释液; LEY, 乳糖蛋黄液; LEYGO, 乳糖蛋黄甘油乳液; TCAI,子宫颈输精

精液冷冻大致包括了降温、细胞脱水、冷冻和解冻过程。在此过程中，温度的剧烈变化、冷冻保护剂引起的渗透压和毒性效应、冰晶的形成以及氧化应激都会造成精子的冷冻损伤。不同动物精子对冷冻的敏感性不同，猪精子最为敏感，其次是马和牛，兔、鸡和人的精子对低温不敏感。影响猪精液冷冻保存的主要因素有品种及个体差异、精液处理、冷冻稀释液和冷冻方法等，其中个体差异因素似乎是影响猪精子冷冻存活率的主要因素。冷冻过程通常会导致30-50%的精子死亡，但更为重要的是有相当一部分存活的精子也遭受到不同程度的损伤，如精子膜和DNA损伤、氧化损伤等，引起精子结构和功能的变化，影响精子受精能力和后续胚胎发育能力。冷冻-解冻的精子会处于“冷冻获能”状态，导致精子在母猪生殖道存活时间短，受胎率和产仔数降低。因此，必须采取相应措施降低冷冻损伤、提高猪精液冷冻保存质量和使用效果。

关于不同公猪精液冷冻敏感性的机制目前仍不清楚，可能与其遗传因素或精液成分有关。猪精子对温度的敏感性自精液采集后就会表现出来，因此有人提出精液冷冻不应在精液采集后6 h内进行，而应在液态保存18-24 h后再挑选质量好的进行冷冻保存。

精液冷冻稀释液应有足够的pH缓冲能力、适宜的渗透压和抗冷冻损伤作用。常用的冷冻稀释基础液为Tris卵黄稀释液、Modena稀释液、beltsville稀释液等。添加促进细胞膜流动性的物质（如卵黄等）可降低精子冷休克的发生，添加胆固醇有助于改善解冻后精子“冷冻获能”状态。同时，应尽量选择毒性低的冷冻保护剂，并优化使用剂量。据报道，甘油的使用浓度通常为4-6%，但随着稀释液中卵黄浓度的增加，甘油浓度可降低至2-3%。

采集精液进行1-2倍稀释后再进行品质评定，选择精子密度大于2亿/mL、精子活力大于80%、畸形率小于15%的精液进行冷冻。精液稀释倍数会影响精子冷冻存活率，稀释倍数不宜过高。剂型宜采用0.25或0.5 mL塑料细管，通过液氮熏蒸或程序冷冻仪进行冷冻，并根据实际情况优化冷冻-解冻条件。

为了对抗精液冷冻-解冻过程的氧化应激，可通过添加抗氧化剂来中和氧自由基（ROS）的不良影响；或通过降低精液氧分压、去除精液中白细胞和异常精子等来减少ROS的产生。近期研究表明，精清、脂质体、胞外囊泡和一些纳米材料有助于改善猪精子冷冻损伤与损伤修复。通过冷冻前去除精清、解冻时添加10%精清的方法（图2），可以显著提高猪冷冻精液配种受胎率。

图2猪精液冷冻解冻新方法（引自Okazaki等（2012））

1, 添加100 mg/mL多粘菌素B；2, 一种改良的冷冻稀释液；3, 将精清加入解冻液。

近年来，猪精液冷冻保存技术取得了突破性进展，冻精人工授精受胎率达到70-80%。由于冷冻精液质量不够稳定、且与液态精液配种效果差距较大，当前不适宜在商品猪生产中广泛应用。但在种猪培育、引种和遗传资源保护等方面，猪精液冷冻技术具有重要的应用价值，尤其是在非洲猪瘟严重威胁优良地方猪种生存和国家高度重视种业发展的背景下，猪精液冷冻技术研发和应用显得尤为重要。

精子库是种质资源库的重要组成部分。当前，国家和政府高度重视畜禽种质资源保护，利用高校和科研院所优势在北京、上海、广东等地建立了多个大型的现代化的猪精子库，对很多优良地方猪种的精液进行保存。

冷冻精液能够实现长期保存和长途运输，能够代替活体引种、降低引种成本和生物安全风险。在育种方面，可保存和充分利用优良种公猪遗传资源，加快育种进程，也有助于转基因猪育种新材料的有效保存。

国内猪精液冷冻技术已经突破商业化生产瓶颈，百钧达、北京田园奥瑞等公司已向育种企业提供精液冷冻服务、设备及试剂耗材。另一方面，推动国内知名育种企业（如广东温氏、上海祥欣）开展猪冷冻精液销售业务，能更大范围的为国内外客户提供优质精液资源。要实现猪冷冻精液的高效应用还需要建立和完善配套的精液复苏和配种技术（如深部输精、适时输精等），同时冷冻精液的推广应用也有助于推动性别控制技术的研究和发展。