母猪深度人工输精技术研究进展

　　猪的人工授精技术始于20世纪30年代,直到80年代中期才在养猪产业中被广泛采用,到目前已经基本取代了自然交配。在猪人工授精中,普遍采用常温精液进行子宫颈输精,可以以取得与自然交配相当甚至更好的繁殖率。但子宫颈输精法,由于输精位置比较靠外,会造成严重的精液浪费,只有通过提高每次的输精量,才能保证受精效果。近年来,随着人工授精技术的进一步发展,猪冷冻精液和性控精液正在试验推广中,精子介导的转基因技术、精子胶囊和精子冻干技术将在未来几年内得到发展。子宫颈输精方式的低效性限制了这类技术的发展,因而需要开发新的输精技术。此外,降低人工授精的精子数量,可降低精液生产成本,促进新技术的应用,而深度输精技术可以很好地解决这一问题,主要包括子宫体输精法、子宫角输精法以及腹腔内窥镜输精法。

　　1 子宫体输精法

　　子宫体输精法是把一个细的半刚性输精装置穿过一个事先插入子宫颈皱褶的常规导尿软管,直接把精液注入子宫体内的输精方式,使精液不经过子宫颈直接到达子宫体[1]。

　　关于常温精液子宫体输精后的效果,存在差异。2002年,Waston等[2]在英国首次利用子宫体和子宫颈两种输精法对3240头经产母猪进行大型商用性试验表明,使用10亿精子进行子宫体输精的产仔率和胎产仔数与30亿精子常规输精相比差异不显著,认为子宫体输精法是一种简单、有效、安全的输精方式。Dimitrov等[3]使用15亿精子进行子宫体输精,产仔率和胎产仔数也不受影响。但是,Roberts等[4]在匈牙利和克罗地亚对1783头经产母猪分别使用10亿精子进行子宫体输精和30亿精子子宫颈输精,尽管两者在受胎率和产仔率上没有显著差异,但子宫体输精法母猪胎产仔数明显减少,与Rozeboom等[5]在美国的研究报道一致。当尝试用5亿精子输精时,产仔率和胎产仔数均显著下降。

　　因此,对于常温精液采用80 mL含有效精子数10亿的精液进行子宫体输精,虽然产仔率不受影响,但胎产仔数可能下降,因而子宫体输精法输精量应在10亿以上。子宫体输精法减少输精数量不会影响受精效果的原因一是半刚性的输精装置可穿过子宫颈皱褶直接把精液输送到子宫体;二是减少了回流的精子数(回流精子数小于20%);关于胎产仔数减少的原因,Roberts等[5]认为是技术人员缺乏经验所致。另外,精子老化以及输精时间与排卵时间间隔不佳,都有可能造成胎产仔数下降。子宫体输精法的不足之处在于,一是半刚性的扩展型输精管可能会损伤生殖道组织;二是对于冷冻精液,子宫体输精法虽然减少了输精数,但所需精液量仍然较大。

　　2 子宫角输精法

　　子宫角输精法是把一个柔韧纤细的输精装置穿过一个事先插入子宫颈皱褶的常规导尿管,将精液直接输入到子宫角。输精装置是由改良的柔韧纤维内窥镜管内置入常规的输精管而制成的,能够顺着子宫腔前进,可将精子输送到一侧子宫角近端1/3处[6]。

　　子宫角输精法在常温精液、冷冻精液和性控精液方面均有一定的研究成果。对于常温精液,在诱导发情条件下Martínez等[6]使用体积10mL、精子数分别为1.5亿和0.5亿的精液进行子宫角输精,与常规输精法相比产仔率和胎产仔数无显著差异,但是将输精数量继续减少到0.25亿和0.1亿时产仔率显著下降。在自然发情条件下,Vázquez等[7]和Day等[8]分别对329头和105头经产母猪采用1.5亿精子子宫角输精和30亿精子子宫颈输精,Vázquez等研究表明产仔率降低2.3%、胎产仔数减少2.1头,但与对照相比无统计学差异;Day等研究表明产仔率降低7%(与对照无显著差异),但试验组的胎产仔数减少了2.4头,显著低于对照组。Dimitrov等[3]和Martine等[9]也得到与Day等相同的研究结果。对于冷冻精液,Roca等[10]分别在诱导发情和自然发情的情况下进行试验,表明诱导发情时使用10亿精子进行子宫角输精与60亿精子子宫颈输精及1.5亿鲜精子宫角输精(对照)相比,三组之间产仔率和胎产仔数均无显著差异。但在自然发情条件下,采用10亿冷冻精子子宫角输精的产仔率显著下降。Bolarín等[11]的研究进一步证明,在自然发情条件下,精确的发情排卵时间非常重要,接近排卵时采取10亿冷冻精子子宫角输精,获得超过80%的产仔率和多于10头的胎产仔数。Wongtawan等[12]建议使用冷冻精子进行子宫深部输精应该在排卵前4~8 h进行。Vázquez等[13]尝试用0.7~1.4亿经过性别筛选的精子对诱导发情处理的母猪进行子宫角输精,产仔率达40%以上,产仔数9头以上。

　　因此,常温精液使用5~10mL含有效精子数1.5亿的精液进行子宫角输精时,如果对母猪进行诱导发情处理,且控制好输精时间,则可以取得与常规输精同样的效果。但是,在母猪自然发情的情况下,则受精效果受到影响。Martínez等[9]认为,这是由于单侧子宫角输精引起的只有部分双侧卵子受精或者仅单侧卵子受精的机率较大。对于常温精液采用子宫角输精法引起的母猪繁殖率的下降可通过适当增加输精数克服。子宫角输精法之所以能进一步减少输精数量而不影响受精效果的主要原因一是可以减少精液倒流和子宫内因白细胞吞噬作用而损失的精子数,二是输入一侧子宫角的精子可以迁移到对侧子宫角,使更多的卵子受精[14]。对于冷冻精液使用子宫角输精法,输精数量应在10亿以上,且要严格控制输精与排卵间隔,否则影响受精效果。因为冷冻精子在雌性生殖道内的存活时间较短(<8h)[12]。对于性控精液来说,子宫角输精法的输精量太大,且受精效果不太理想。总之,子宫角输精法进一步减少了常温精液的输精数量,使冷冻精液也取得了较好的受精效果,同时也使性控精液的人工授精成为可能。但是,子宫角输精法一方面对输精技术要求较高,操作不当容易造成生殖道损伤,初配母猪子宫颈较细,要慎用,因而对输精人员要进行技术培训;另一方面要控制好输精排卵间隔,否则会影响受精效果。

　　3 腹腔内窥镜输精法

　　当用高附加值的精子(即性控精子或精子介导的转基因精子)进行人工授精时,开发利用超低精子数的小剂量输精技术可以提高受精效率,而输卵管内输精被认为能够最大限度地减少每次输精所需的精子数。Krueger等[1]使用剖腹手术将0.1亿精子注射到子宫输卵管连接部,获得了88.9%的受胎率。腹腔镜人工授精技术是利用腹腔内窥镜装置,通过微创手术,将精液直接输入到子宫输精管连接部。V azquez等[15]对腹腔镜手术进行改进,将母猪麻醉后,使头向下呈20°角仰卧,在接近肚脐处切1.5 cm小口,用特殊装置将精液准确输入到输卵管壶腹部。与剖腹手术相比,腹腔镜输精技术在将精子直接输入子宫或输卵管时,所造成的创伤要小得多。

　　腹腔内窥镜输精法主要被应用于性控精液。Fantinati等[16]对同期发情处理的母猪采用腹腔镜输精法,分别将少量精液输入两侧接近子宫输卵管连接部,表明将输精量减少到0.1亿时,受精率不受影响。Vázquez等[17]在每侧子宫角输入30万个性别分离精子,获得80%的受孕率。Roca等[18]对87头母猪采用腹腔镜输精法,输入100~300万液态保存的性控精子,产仔率超过70%,平均胎产仔数达到10头。另外,Vázquez等[19]通过对比排卵前、排卵时和排卵后的受精效果,表明性控精液必须在排卵前输精才可获得最高的繁殖率。

　　因此,腹腔内窥镜输精法对于性控精液较为适合,且是目前唯一性控精液受精后能取得理想繁殖率的输精方法。即在排卵前将30万精子输入两侧输卵管就能获得较高的产仔率。且Parrilla等[20]认为,如果能正确操作此项技术,对母猪的繁殖性能没有影响。但是,与冷冻精液一样,性控精液进行输精时,其受精效果与排卵时间密切相关。虽然性控精子在雌性生殖道的存活时间没有确定,但是存活时间缩短。这可能是只有在排卵前很短的时间内,将性控精液输入到输卵管部位才能获得较高的繁殖率的原因[18]。相反,若是在排卵时或排卵后进行输精,此时会引发大量的多精入卵[19]。因此,有必要在输精前对母猪进行诱导发情处理,精确排卵时间,避免多精入卵和局部受精现象。另外,腹腔内窥镜相对于普通的人工授精器械较为复杂,造价较高,而且需要专业水平较高的技术人员操作,对于此项技术的推广应用还有待进一步研究。

　　4展望

　　对于常温精液深部输精,在不影响人工授精效果的同时,减少了输精数量,意味着育种群中优秀公猪的应用范围将更广,选择的强度和准确度得以提高,选育的进程将更快。因此,深部输精技术被视为在精源有限、提高高质量种公猪精液利用率的条件下实用、有效的人工授精方式。冷冻精液对于保存优良种公猪或濒危品种公猪的精液,实现遗传资源的长期保存,尤其对我国众多地方品种的保种工作具有重大意义。世界上已经召开了七次关于猪精液冷冻保存的大型国际会议,研究者在保存方法、精液冷冻处理程序等方面作了大量工作,对猪精液冷冻保存的发展起到了积极的推动作用。但

　　目前冷冻精液在猪人工授精中的应用不到1%,究其原因是冷冻精液子宫颈输精的繁殖率低于液态精液,且输精量较大,而深度输精技术是改善冷冻精液受精效果的有效方式。性控精液为猪人工授精领域开拓了新的方向。若能将性控精液应用于猪人工授精中,将极大地促进遗传育种的进程。因此,对于猪性别控制的要求十分迫切,而深度输精技术实现了利用性控精液进行人工授精。深度输精技术减少了输精数量,而不会影响受精效果。与传统输精法相比,子宫体输精法将常温精液的用量减少了3倍;子宫角输精法使常温精液用量减少了5~20倍,冷冻精液的用量减少了6倍;腹腔内窥镜输精法仅使用30万性别分离精子就能获得较高的受孕率。因此,对于猪的输精技术还应继续探索研究,以期为养猪业做出更多的贡献。

作者：西北农林科技大学 刘玉 王鹏等