融合抗菌肽实验研究及猪场疫病防控实际应用效果

　　一、猪场疫病现状及发展态势
　　自从HPRRS出现后，HPS,SS,PRDC等疫病时常以混合感染的形式出现，PCV2及PCVAD近年来在全国蔓延，FMD大范围的频繁出现，呈现出高发病率，PED在全国肆虐，造成了极高的死亡率，ERY卷土重来，PR又掀风波。
　　当今猪场主要疫病及混合感染情况——通过对7972例保育猪病料病原混合感染检测结果统计（吴斌2012）混合感染模式共达263种。其中最常见的9种混感模式例举如下：

 

　　当前形势严峻，前景堪忧，除与猪群生存环境恶化，霉菌毒素等有关外，还与PRRS、PCV2免疫抑制病有关。防控新思路：加强饲养管理，严格生物安全措施，减少滥用药物及免疫，增强猪群抵抗力。
　　二、猪场常规免疫宏观效果评价
　　1. HCLV，PR，PPV，JEV，MP等均被认同
　　2. PCV2苗近年为国内外学者认同
　　3. FMD与毒株、剂量、免疫次数等密切相关
　　4. PRRS  MLV争议较大，主要疫争议点：
　 PRRS免疫机制未明确
 　PRRSV特性：ADE，持续感染，机体难发现，免疫反应后延等
　 当前滥用、错用、大量免疫、频繁免疫、强制免疫都是不科学的
 　PRRS  MLV实际免疫应关注点未能明确指出
　　现在猪场生产中迫切需求减少猪场及猪群体内PRRSV 病毒载量的有效制剂。
　　三、抗菌肽（AMPs）及其生物学特性
    　抗菌肽是一类具有抗菌活性的阳离子短链多肽的总称，也是先天免疫系统的组成部分，具有生物效应靶向性，对多种病原体（细菌、病毒、真菌、寄生虫）和癌细胞具有杀伤或抑制作用，而对真核细胞不具细胞毒作用。抗菌肽生物活性稳定：在高离子强度和酸碱环境中或100℃加热10分钟时仍具有杀/抑菌作用，同时具有协同抗菌效应：能与宿主体内某些阳离子蛋白、溶菌酶或抗生素协同作用，增强其抗菌效应；具有与抗生素不同的杀菌机制，不易产生抗菌肽耐药菌株；能与细胞脂多糖（LPS）结合，中和内毒素，防治革兰氏阴性菌败血症和内毒素中毒性休克；具有免疫调节作用，可招募并增强吞噬细胞的杀菌作用，而降低由前炎症细胞因子引发的炎症反应。
　　四、融合抗菌肽（金源肽）构建和表达研究主要内容
　　1. 筛选、组合抗菌效应互补的抗菌肽——MAPWA 及PGBD-2（国家发明专利号201110068695.3），形成融合抗菌肽
　　2. 融合抗菌肽MAPWA（蛙皮素-美洲商陆素抗菌肽）
　　3. 融合抗菌肽PGBD-2（猪PG-1与防御素PBD-2抗菌肽）
　　4. 融合抗菌肽高效表达质粒及转化研究
　　5. 融合抗菌肽基因真核高效表达研究
　　五、融合抗菌肽体外对猪免疫调节和抑制病毒复制的研究
　　用P1和P2（MAPWA和PGBD-2）与猪免疫细胞在体外培养，MTT法观察它们对免疫细胞的刺激增殖活性；同时加入PRRSV共培养，以定量实时RT-PCR技术检测免疫细胞和Marc-145细胞及培养液中的PRRSV病毒含量。结果发现：P1和P2融合抗菌肽具有显著的免疫激活特性，P2的免疫刺激作用较强；同时P1和P2融合抗菌肽能够显著减少PRRSV在免疫细胞和Marc-145细胞的复制量；证明融合抗菌肽PGBD-2和MAPWA具有显著的免疫增强效应，并且能显著地抑制病毒复制，减少其在靶细胞中的含量。提示融合抗菌肽分子具有免疫强化作用和抑制PRRSV在靶细胞复制的效应。

图1  P1和P2融合抗菌肽对猪免疫细胞的刺激效应

图2 不同处理免疫细胞中PRRSV含量随培养时间的变化结果

图3  P1和P2处理对PRRSV在Marck 145 细胞中复制的影响

　　六、融合抗菌肽产品对猪体内PRRSV及PCV2带毒率影响的初步观察
　　母猪日粮从配种后1月龄至哺乳结束全程添加2‰金源肽Z30。其后代仔猪日粮中在教槽料和保育料中分别按8‰、2‰添加金源肽Z10直至保育结束。结果发现：金源肽饲料饲喂的后备母猪体内血液免疫细胞的IL-10基因表达量较对照后备母猪显著下降，而其CD4基因表达水平显著增高；实验组后备母猪的PRRSV和PCV2带毒率率明显减少，病毒含量也显著降低；实验母猪和仔猪的特异性猪瘟抗体含量明显高于对照猪。这些表明：金源肽产品添加入饲料可显著增强动物的免疫调节水平，提高抗PRRSV和PCV2感染的能力，有助于控制、减少病毒在体内的复制；对仔猪和后备母猪的健康和生长发育均有良好的促进作用。

图4 金源肽饲喂后备母猪血液PRRSV含量的变化

图5 实验猪血液PCV2的含量变化

图6 实验猪血液免疫细胞IL-10基因表达量的变化